Программа «Геном человека»: цели и методы

Ставились три основные цели программы:

• создание точной генетической карты,

• создание физической карты,

• секвенированис всего генома человека.

1. Создание генетической карты генома

Генетические карты показывают линейное расположение маркерных сайтов, расстояние между которыми выражают в сантиморганах (условная единица частоты рекомбиации гомологичных хромосом в профазе мейоза). Расстояние между локусами равно 1 сМ, если частота рекомбинации между ними составляет 1 %, что соответствует физическому расстоянию около 1 млн п. н. или 1 мегабазе. При этом частота рекомбинации, а, следовательно и реальная длина 1 сМ, варьируют в разных частях генома, поэтому на генетических картах реальное (физическое) расстояние является ориентировочным показателем.

Для создания генетической карты необходимо найти в геноме большое количество полиморфных генетических маркеров, а для анализа сцепления между этими маркерами установить их взаимное расположение, используя большое количество семей. Для этого имеются различные типы ДНК-полиморфизмов, а именно:

• полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ);

• полиморфизм, обусловленный варьирующим числом тандемных повторов: три-, тетра- и пентануклеотидных, или VNTR-полиморфизм;

• полиморфизм мини-сателлитов, состоящих из тандемно повторяющихся единиц длиной 20-70 п. н.;

• полиморфизм микросателлитов из повторяющихся единиц длиной 5 п. н.;

• однонуклеотидный SNP-полиморфизм, обусловленный изменением одного нуклеотида в определенных последовательностях ДНК у разных людей («снипсы»).

Все перечисленные полиморфные маркеры проявляют менделевское наследование, а все вместе дают возможность плотно маркировать геном человека. Среднее расстояние между маркерами составило менее 1 сМ (менее 1 млн п. н.). Взаимное расположение маркеров устанавливалось на основе коллекции клеточных линий от членов нескольких сотен семей на протяжении трех поколений. В каждой хромосоме устанавливалось и картировалось взаимное расположение 10-15 полиморфных маркеров. В настоящее время в геноме человека локализовано около 6 тыс. полиморфных ДНК-маркеров. среднее расстояние между которыми равно 1 сМ. На таком участке может локализоваться около 10 генов.

2. Создание физической карты генома

Физическое картирование — это определение места локализации и взаиморасположения генов, участков кДНК или каких-либо генетических маркеров (например, STS-маркеров, сайтов узнавания рестриктазами и т.д.) присутствующих в исследуемой молекуле ДНК. Физические карты всего генома, отдельной хромосомы или ее сегмента строятся на основе прямого исследования генетического материала. Они дают представление о реальном расположении генов по длине ДНК. Расстояние между ними и фланкирующими их маркерами выражается в числе п. н., что облегчает их идентификацию, изучение и секвенирование.

Необходимое маркирование генома проводят с помощью секвенированных фрагментов размером несколько сот п. н. — STS-маркеров, которые легко идентифицируются методом ПЦР (полимеразной цепной реакции). Получено более 50 тыс. разбросанных по геному STS — при физическом картировании их используют как маркеры перекрывающихся сегментов ДНК. Перекрывающиеся фрагменты ДНК, ранее клонированные в искусственных бактериальных (ВАС-) или дрожжевых (YAC) хромосомах, используют для построения так называемых контиг (contigs) - протяженных отрезков ДНК. Контиг — это набор упорядоченных перекрывающихся клонов ДНК, охватывающих всю хромосому или ее участок, измеряемый в числе п. н.; служит основой для построения окончательного варианта физической карты.

При окончательной оценке размеров генома человека и идентификации генов учитывается существенная разница масштабов генетических, физических (молекулярных) и цитологических карт. Установлено, что 1 сМ на генетической карте соответствует приблизительно одному «бэнду». Бэнд — это полоса, видимая в световом или люминисцентном микроскопе после окраски хромосом. В свою очередь один «бэнд» прометафазной хромосомы соответствует 1 млн п. н. Средние размеры одного гена составляют 100-200 тыс. п. н., следовательно, при физическом картировании реально определяется участок из 5-10 генов-кандидатов.