2.4 Детекция продуктов пцр

Детекция продуктов пцр проводится с применением вертикального и горизонтального электофореза. Большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Результаты амплификации оценивались путем проведения горизонтального электрофореза (камера и блок питания Peqlab) в 3% агарозном геле в однократном TRIS-борат-ЭДТА буфере (1xTBE).

Оптимальным было использование тринадцатилуночных гребёнок: в один гель вносились до 11 образцов (анализировалось до одиннадцати человек за один раз), в двенадцатую лунку обычно вносился маркер молекулярного веса («Праймтех», РБ), который позволяет определять молекулярный вес ампликонов.

Время проведения электрофореза зависит от молекулярной массы амплифицированного продукта. Но в случае ПЦР - КДПП этот показатель не является критичным. Время электрофореза составляло в среднем 60 минут.

Анализ гелей проводился с помощью трансиллюминатора CN-1000 Darcroom (Vilbcr Lourmal, Германия) с оригинальным программным обеспечением.

Для детекции ДНК-амплификатов в ультрафиолете (λ=260нм) использовали 0,1% раствор бромистого этидия в 1xTBE. Экспозиция геля в растворе перед анализом составляла 10-12 минут. Дальнейший денситометрический анализ с помощью программы Vision-Capt определил это время как оптимальное. С помощью расширенных функций данной программы можно было определять молекулярную массу продукта амплификации, корректировать изображение в реальном времени (благодаря высокочувствительной фотокамере, ассоциированной непосредственно с трансиллюминатором), фотографировать и сохранять изображение для последующего его анализа.

2.5 Методика проведения аллелеспецифического пцр с детекцией продукта

Для постановки реакции амплификации использовался ПЦР-амплификатор Primus 96 advanced GRADIENT (PEQLAB Германия). Этот амплификатор позволил подобрать оптимальную температуру отжига праймеров используемых в данной работе, благодаря функции градиента температур, устанавливаемого в необходимом температурном интервале.

Анализ проводился по двум полиморфизмам – ADH2 (Arg47His G>A) и ALDH2 (Glu487Lys G>A). Нами была использована методика постановки ПЦР с конкурирующими двумя парами праймеров (ПЦР-КДПП) – метод определения полиморфизма единичного нуклеотида производит аллелеспецичиские бенды с различными длинами посредствам добавления четырёх разработанных праймеров в одну пробирку, содержащую обычно приготовленную смесь для ПЦР [25].

Также нами была проведена серия экспериментов по оптимизации ПЦР с различными рН буферного раствора, в результате чего нами были подобраны оптимальные значения рН для проведения амплификации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Кулинский, В. И. Обезвреживание ксенобиотиков. Монография; Соросовский образовательный журнал / В. И. Кулинский - М., 1999. – 56 с. 7

2. Encyclopedia of Earth [Электронный ресурс]/ Eds. Cutler J. Cleveland / Ecology Theory: Biotransformation/ Режим доступа: http://www.eoearth.org. – Дата доступа: 05. 04. 2012.

3. Биохимия печени [Электронный ресурс]/Биохимия для студента/ Режим доступа: www.biokhimija.ru. – Дата доступа: 05. 04. 2012.

4. Саприн А.Н. Ферменты метаболизма и детоксикации ксенобиотиков Успехи биологической химии. М.: Наука. 1991, 32,146-172.

5. Райс, Р. Х., Гуляева, Л. Ф. Биологические эффекты токсических соединений/ Курс лекций // Р.Х. Райс – Новосибирск, 2003, 208с.

6. Фирсов, Н. Н. Микробиология: словарь терминов// Н. Н. Фирсов - М: Дрофа, 2006 г.

7. Спицын, В. А., Макаров, С. В., Пай, Г. В., Бычковская, Л. С. Полиморфизм в генах человека, ассоциирующихся с биотрансформацией ксенобиотиков / Вестник ВОГиС , 2006, Том 10, № 1 Москва, Россия.

8. Макарова, С. И. Роль полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к атопическим заболеваниям гепатотоксичности противотуберкулезной терапии: автореферат диссертации док. биол. наук: 03.02.07/С. И. Макарова; Рос. акад. естествознания – Уфа, 2011.

9. Christ-Hazelhof E. , Nugteren D.H. , Van Dorp D.A. Conversions of Prostaglandin Endoperoxides by Glutathione-S-Transferases and Serum Albumins. // Bioch. Bioph. Acta 1976, v. 450, pp. 450-461. Bioch. Bioph. Acta 1976

10. Cao K., Stack D. E., Ramanathan R., Gross M. L., Rogan E. G., Cavalieri E. L. Synthesis and structure elucidation of estrogen quinones conjugated with cysteine, N-acetylcysteine, and glutathione // Chem. Res. Toxicol. 1998. Vol. 11. P. 908-916.

11. Thier R, Brüning T, Roos PH, et al. Markers of genetic susceptibility in human environmental hygiene and toxicology: the role of selected CYP, NAT and GST genes // Int J Hyg Environ Health. 2003 Jun;206(3): 149-71

12. Мартов, С. И., Севостьянова, Н. В., Дмитриева, А. И. и др. Полиморфизм генов ферментов первой и второй фазы биотрансфор-мации ксенобиотиков у больных раком желудка // Мартов С. И. // Сибирский онкологический журнал, 2010, №4 (40)

13. Fryer AA, Zhao L, Alldersea J, et al. Use of site-directed mutagenesis of allele-specific PCR primers to identify the GSTMJ A, GSTM1 B, GSTM1 A 3 and GSTM1 null polymorphisms at the glutathione S-transferase, GSTM1 locus // Biochem J 1993;295: 313-15.

14. Дедков, А. А., Богомазов, А. Д., Иванов, В. П., и др. Исследование полиморфизма ILE105VAL гена GSTP1 с развитием атопической бронхиальной астмы у детей в Курской области / Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2011, № 1, Курск, РФ.

15. Lin HJ, Han CY, Bernstein DA, et al. Ethnic distribution of the glutathione transferase Mu 1-1 (GSTMI) null genotype in 1473 individuals and application to bladder cancer susceptibility// Carcinogenesis 1994; 15:1077-81.

16. S. C. Cotton, L. Sharp, J. Little, and N. Brockton. Glutathione S-Transferase Polymorphisms and Colorectal Cancer: A HuGE Review //American Journal of Epidemiology Vol. 151, No. 1

17. A.S.Wenzlaffl, M.L.Cote1, C.H.Bock1, et al. GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms, environmental tobacco smoke exposure and risk of lung cancer among never smokers: a population-based study // Carcinogenesis vol.26 no.2 pp. 395-401, 2005.

18. Martha L. Slattery, Sandra Edwards, Karen Curtin,et al. Associations between Smoking, Passive Smoking, GSTM-1, NAT2, and Rectal Cancer // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. Vol. 12, 882–889, September 2003.

19. Elexpuru-Camiruaga J, Buxton N, Kandula V, et al. Susceptibility to astrocytoma and meningioma: influence of allelism at glutathione S-transferase (GSTT1 and GSTM1) and cytochrome P-450 (CYP2D6) loci // Cancer Res 1995; 55:4237-9.

20. R. Mullin. Personalized Medicine // Chemical and engineering news, February 11, 2008 Volume 86, Number 06 pp. 17-27.

21. Корчагина, Р. П., Осипова, Л. П., Вавилова, Н. А., и др. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, Cyp2D6, вероятных маркеров риска онкологических заболеваний, в популяциях коренных этносов и русских северной сибири / Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 3, Новосибирск, РФ.

22. B. Sprudle, Penelope M Webb et al. Polymorphisms at the glutathione S-transferase GSTM1, GSTT1 and GSTP1 loci: risc of ovarian cancer by histological subtype// Cancirogenesis vol. 22 no. 1 pp. 67 – 72, 2001

23. Mark Welfare, A. Monesola Adeokun, Margaret F. Bassendine, and Ann K. Daly. Polymorphisms in GSTP1, GSTM1, and GSTT1 and Susceptibility to Colorectal Cancer // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. Vol. 8, 289–292, April 1999.

24. Karen Curtin1, Wade S. Samowitz2, et al. Somatic alterations, metabolizing genes, and smoking in rectal cancer // Int J Cancer. 2009 Jul 1;125(1):158-64

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ТАБЛИЦА 1: Оценка относительного риска развития раковых заболеваний в зависимости от генотипа по ферментам семейства ГСТ

Ген	Заболевание	Количество испытуемых	Относит. Риск (RR)	95% CI	Примечания
ГСТМ	Рак кишечника	196+225 (к)	1,8	1,2 - 2,6	Без дифференцировки по полу, возрасту, национальности
ГСТМ	Рак кишечника	132+200 (к)	0,9	0,6 - 1,4
ГСТМ	Аденокарцинома	103+126 (к)	1,5	0,9 - 2,6
ГСТМ	Рак кишечника	252+577 (к)	1	0,7 - 1,3
ГСТМ	Рак кишечника	219+200 (к)	1	0,7 - 1,4
ГСТМ	Рак кишечника	212 (total)	1	0,7 - 1,5
ГСТМ	Карцинома кишечника	300+183 (к)	0,8	0,5 - 1,1
ГСТМ	Рак яичников	неизвестно	0,8	0,35 - 1,85
ГСТТ	Рак яичников	56+239(к)	1,05	0,68 - 1,61
ГСТМ	Рак яичников	155+162 (к)	1,03	0,73 - 1, 45
ГСТМ	аденоматозный полип	446+488 (к)	0,9	0,7 - 1,1
ГСТТ	Аденокарцинома	125+94 (к)	0,7	0,3 - 1,4
ГСТТ	Рак кишечника	211+509 (к)	1,9	1,3 - 2,7
ГСТТ	Аденокарцинома	103+126 (к)	1,2	0,7 - 2,0
ГСТТ	Рак кишечника	219+200 (к)	3,4	2,1 - 5,4
ГСТТ	Рак кишечника	212+221 (к)	0,8	0,5 - 1,2
ГСТТ	Рак яичников	неизвестно	0,91	0,39 - 2,14
ГСТМ+ГСТТ	Рак яичников	29+264 (к)	1,12	0,62 - 2,05

Ген	Заболевание	Количество испытуемых	RR	95% CI	Примечания
ГСТМ	Рак легких	16+23 (к)	0,52	0,22 - 1,23	Среди некурящих, не подвергавшимся воздействию пассивного курения
ГСТТ	Рак легких	6+12 (к)	0,32	0,1 - 1,03
ГСТП Иле/Вал	Рак легких	21+27 (к)	1,01	0,40 - 2,54
ГСТП Вал/Вал	Рак легких	6+6 (к)	1,57	0,4 - 6,19
ГСТМ+ГСТТ	Рак легких	2+6 (к)	0,16	0,03 - 0,93
ГСТТ+ГСТП	Рак легких	4+8 (к)	0,38	0,08 - 1,73
ГСТМ+ГСТП	Рак легких	7+14 (к)	0,45	0,12 - 1,67
ГСТМ	Рак легких	43+35 (к)	2,32	1,05 - 5,13	Среди некурящих, подвергавшихся пассивному курению более 20 лет
ГСТТ	Рак легких	14+16 (к)	1,16	0,48 - 2,79
ГСТП Иле/Вал	Рак легких	29+35 (к)	1,29	0,56 - 3,00
ГСТП Вал/Вал	Рак легких	8+6 (к)	1,72	0,48 - 6,12
ГСТМ+ГСТТ	Рак легких	7+9 (к)	1,89	0,5 - 7,13
ГСТТ+ГСТП	Рак легких	6+8 (к)	1,73	0,43 - 7,00
ГСТМ+ГСТП	Рак легких	21+25 (к)	4,56	1,21 - 17,21

17