2.2.1 Забор образцов

Взятие соскоба с внутренней стороны щеки производится при помощи набора, содержащего индивидуальный аппликатор, упакованный в пластик (9х15 см), и помещенный в опломбированный пакет.

Образец высушивают, пакеты сново пломбируют. Готовый образец можно хранить при комнатной температуре.

2.2.2 Приготовление образцов

Из каждого фиксированного образца вырезают круглый участок диаметром 3 мм.

Вырезанный участок трижды покрывают метанолсодержащим составом, затем высушивая на воздухе в первый раз при комнатной температуре в течение 20 минут, затем дважды – при температуре 37 °С в течение 40 минут. Метанол стимулирует преципитацию гема к бумаге.

С помощью щипцов высохшие образцы переносят в тонкостенные (0,2 мл) пцр-пробирки и приливают 5 µл буфера и 45 µл дист. воды. Образцы инкубируют последовательно при 60 °С в течение 30 минут; 99,9°С в течение 10 минут; 4 °С до остывания.

Перед началом инкубации добавляют протеинкиназу К (50 µг/мл), которая инактивируется при температуре 99,9 °С. Это позволяет улучшит сохранность генетического материала.

2.3 Аллельспецифичный пцр. Проведение.

Для эффективного осуществления ПЦР 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов может отсутствовать вообще. Именно эта особенность ПЦР и лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР, иначе называемой аллель-специфической элонгацией праймера ( allele specific primer extension ).

Другой тип универсальных аллель-специфических праймеров содержит 3'-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть (см. рис. II.34,а,в ). В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов. Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена иногда используют мутантный и нормальный праймеры разных размеров, которые различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, полностью комплементарных анализируемой ДНК. В этом случае в процессе ПЦР в реакционную смесь можно одновременно добавлять оба аллель-специфических праймера: мутантный и нормальный вместе с общим для обоих праймеров - встречным. Образовавшиеся продукты реакции, соответствующие мутантному аллелю и аллелю дикого типа, далее разделяют электрофоретически в гелях, используемых для секвенирования нуклеиновых кислот.

При использовании аллель-специфических праймеров для обнаружения мутаций необходимо иметь в виду, что не все сочетания ошибочно спаренных с матрицей 3'-концевых нуклеотидов одинаково эффективны в блокировании ПЦР. Наименьшей способностью к элонгации праймеров с ошибочно спаренными 3'-концевыми нуклеотидами обладает так называемый фрагмент Шоффлера Taq-полимеразы , который представляет собой молекулу ДНК-полимеразы T.aquaticus, укороченную с N-конца на несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время в этом методе не применимы термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие 3'->5'-корректирующей активностью, например Vent-полимераза.