5. Методика выполнения практической работы.

Практические задания:

Задачи в плане УИРС:

1. Строение и виды гемоглобина.

2. Определение количества гемоглобина.

3. Виды гемолиза эритроцитов.

4. Определение осмотической резистентности эритроцитов.

РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА.

Гемоглобин является главной составной частью эритроцитов. Это сложный хромопротеид, состоящий из белка глобина и пигмента гема, от которого зависит цвет крови. В состав гема входит один атом двух валентного железа, который обуславливает способность гемоглобина вступать в соединение с кислородом.

Содержание гемоглобина в крови у здоровых женщин составляет 120-140 г/л, а у мужчин - 130-160 г/л.

Определение содержания гемоглобина в крови производится калориметрическими способами, один из которых (гематиновый метод Сали) основан на образовании устойчивого раствора коричневого цвета при взаимодействии гемоглобина с хлористоводородной кислотой.

Г емометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из белого матового стекла. В штатив вставлены три пробирки одинакового диаметра. Две крайние пробирки запаяны и содержат стандартный раствор гематина; средняя градуирована. Она предназначена для проведения исследований. К прибору прилагается пипетка с меткой 20 мм и стеклянная палочка. Стандартный раствор хлорида гематина соответствует 167 г/л гемоглобина.

Для работы необходимо: гемометр Сали, пипетка, скарификатор, вата, 0,1н раствор HCl, спирт, эфир, йод, дистиллированная вода. Работа проводится на человеке.

Ход работы. В среднюю пробирку гемометра наливают 0,1н раствор HCl до нижней метки. Пипеткой берут 20 мкл крови из пальца и, обтерев кончик ее ватой, тотчас выдувают кровь на дно пробирки так, чтобы верхний слой кислоты оставался неокрашенным. Не вынимая пипетку споласкивают ее кислотой. После этого содержимое пробирки перемешивают, ударяя пальцами по дну пробирки, и ставят в штатив на 5-10 мин. Это время необходимо для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин. Затем к содержимому пробирки добавляют по каплям дистиллированную воду до тех пор, пока цвет полученного раствора не будет совершенно одинаков с цветом стандарта боковых пробирок (добавляя воду - раствор перемешивают стеклянной палочкой).

Цифра, стоящая на уровне полученного раствора, показывает содержание гемоглобина в испытуемой крови.

Рекомендации к оформлению работы. Объясните принцип метода определения количества гемоглобина в крови.

РАБОТА 2. ВИДЫ ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ.

Гемолиз - это разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму крови. Гемолизированная кровь прозрачна и называется "лаковой". Под микроскопом в ней не видно эритроцитов, так как они разрушены. Не выполняя своей основной дыхательной функции, гемолизированная кровь оказывает вредное воздействие на организм.

Возможно развитие Г. под влиянием бактериальной или вирусной инфекции, при воздействии лекарственных средств (ПАСК, фенацетина, пенициллина, метилдофы и др.). Он может иметь место при механическом повреждении мембраны эритроцитов, например при соприкосновении эритроцитов с протезом клапана сердца, в аппарате искусственного кровообращения. Повреждающее (гемолитическое) действие на мембрану эритроцитов оказывают нитриты, нитробензол, нитроглицерин, эфир, бензол, некоторые органические кислоты (например, уксусная), соединения мышьяка, свинца, а также амины, гидрозины и др. Гемолитическим действием обладают яды глистов, насекомых (пчелы, каракурта, скорпиона), змей. Механизм гемолитического действия ядов связан, по-видимому, с изменением структуры липидного компонента мембраны эритроцита.

Под микроскопом в ней не видно эритроцитов, так как они разрушены. Не выполняя своей основной дыхательной функции, гемолизированная кровь оказывает вредное воздействие на организм.

Для работы необходимо: штатив с пятью пробирками, пипетки, физиологический раствор, дистиллированная вода, 0,1% раствор HCl, раствор аммиака, 5 мл цитратной крови любого животного (в пробирке).

Ход работы.

1)В штатив ставят 4 пробирки, в каждую из которых наливают по 3 мл соответственно физиологического раствора, дистиллированной воды, 0,1% раствора HCl и 5% раствора аммиака; в 5-й пробирке - цитратная кровь.

2)Во все 4 пробирки вносят пипеткой по две капли из 5-й пробирки. Оставшуюся в 5-й пробирке кровь помещают на 1 час в морозильную камеру холодильника. Затем пробирку вынимают и оттаивают в стакане с горячей водой.

3)Рассматривая содержимое всех 5-ти пробирок, сравнивают результаты.

Рекомендации к оформлению работы. Определите наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Опишите механизм и вид гемолиза в каждой пробирке.

РАБОТА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ.

Ход работы. В штативе устанавливают 9 чистых сухих пробирок. Пипетку несколько раз промывают тем реактивом, который предстоит отмерить. Сначала вносят в пробирки 1% раствор хлорида натрия, затем дистиллированную воду, как указано в таблице. После этого перемешивают растворы, встряхивая пробирки.

Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Кол-во мл 1% р-ра хлорида натрия	9	8	7	6	5	4	3	2	1
Количество мл воды	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Концентрация р-ра хлорида натрия, %	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1

В каждую пробирку вносят по капле цитратной крови. Перемешав кровь, оставляют пробирки на один час, затем смотрят результат. Если гемолиза не произошло, эритроциты осядут на дно пробирки, а над ними будет чистый раствор. Если произошел частичный гемолиз, излившийся гемоглобин придает раствору красный оттенок. При полном гемолизе жидкость в пробирке будет однородного красного цвета, а на дне ее не окажется эритроцитов. Отмечают, в какой пробирке гемолиз только начался (обычно при 0,5%), а в какой он произошел полностью (обычно при 0,4%).

РАБОТА №4. РАСЧЕТ ЦВЕТОВОГО ПОКАЗАТЕЛЯ.

Цветовой показатель – это соотношение между количеством гемоглобина крови и числом эритроцитов носит название. Цветовой показатель позволяет определить степень насыщения эритроцитов гемоглобином.

В 1 мкл крови в норме содержится 166*10^-6 г гемоглобина и 5,00*10⁶ эритроцитов, следовательно содержание гемоглобина в 1 эритроците в норме равно:

166 · 10-6	= 33 · 10 -12 пг (пикограмм).
5,00 · 106

Величину в 33 пг, составляющую норму содержания гемоглобина в 1 эритроците, принимают за 1 (единицу) и обозначают как Цветовой показатель.

Практически вычисление Цветового показателя (ЦП) производят путем деления количества гемоглобина (Hb) в 1 мкл (в г/л), на число, состоящее из первых 3-х цифр количества эритроцитов с последующим умножением полученного результата на коэффициент 3.

ЦП=	Hb (гемоглобин), г/л	· 3
	число эритроцитов (первые 3 цифры)

Например, Hb=167 г/л, Количество эритроцитов - 4,8·10¹² (или 4,80·10¹²). Первые три цифры количества эритроцитов - 480.

ЦП=167 / 480 · 3 = 1,04

В норме цветовой показатель находится в пределах 0,86—1,05

В практической работе удобно пользоваться для подсчета цветового по­казателя пересчетными таблицами и номограм­мами. По величине цветового показателя приня­то делить анемии на гипохромные (ниже 0,8); нормохромные (0,8—1,1) и гиперхромные (вы­ше 1,1).

Клиническое значение. Гипохромные ане­мии — это чаще железодефицитные анемии, обусловленные длительными хроническими кровопотерями. В данном случае гипохромия эрит­роцитов обусловлена дефицитом железа. Гипо­хромия эритроцитов имеет место при анемии беременных, инфекциях, опухолях. При талассемии и отравлениях свинцом гипохромные анемии обусловлены не дефицитом железа, а нарушени­ем синтеза гемоглобина.

Наиболее частой причиной гиперхромной анемии является дефицит витамина В₁₂, фолиевой кислоты.

Нормохромные анемии наблюдаются чаще при гемолитических анемиях, острой кровопотере, апластической анемии.

Однако цветовой показатель зависит не толь­ко от насыщения эритроцитов гемоглобином, но и от величины эритроцитов. Поэтому морфоло­гические понятия о гипо-, нормо- и гиперхромной окраске эритроцитов не всегда совпадают с дан­ными цветового показателя. Макроцитарная анемия с нормо- и гипохромными эритроцитами может иметь цветовой показатель выше едини­цы, и наоборот, нормохромная микроцитарная анемия дает всегда цветовой показатель ниже. Поэтому при различных анемиях важно знать, с одной стороны, как изменилось общее содержание гемоглобина в эритроцитах, и с другой,— их объем и насыщенность гемоглобином.