14.2. Остановка репликации и ресинтез. Привлечение белков репарации

   Как мы уже неоднократно говорили, повреждения ДНК можно разделить на те, которые приводят к мутациям, но не способны остановить движение репликативной вилки, и те массивные повреждения ДНК, которые напрямую останавливают ее репликацию. Мы уже обсуждали возможные пути репарации таких повреждений и последующего ресинтеза. Индуцированная повреждениями ДНК остановка репликации приводит к привлечению многих белков репарации к месту повреждения, то есть к остановленной вилке репликации. Как именно происходит это привлечение до сих пор окончательно не ясно. Во время нормального процесса репликации ДНК PCNA (proliferating cell nuclear antigen) образует скользящий зажим и стимулирует процесс репликации ДНК-полимеразами. «Загрузка» PCNA на ДНК осуществляется так называемым «загрузчиком зажима» (clamp loader), которым является фактор репликации С (RFC). При аресте репликации многочисленные факторы могут выполнять функции PCNA и RFC. Функцию PCNA при репарации ДНК берет на себя, вероятнее всего, «зажим, специфический для поврежденной ДНК» (Rad9-1-1 комплекс), состоящий их белков Rad9, Hus1 и Rad1. Эти белки служат стыковочной платформой для многочисленных репарационных белков. Здесь уместно отметить, что Hus1 под действием ионизирующей радиации перемещается из цитоплазмы в ядро, где соединяется с PCNA и Rad9.

   Другой человеческий белок Rad17 связан с хроматином еще до повреждения ДНК. В ответ на повреждение он фосфорелируется белком АТМ и затем способствует присоединению к хроматину комплекса Rad9-1-1. У человека и дрожжей показано непосредственное объединение Rad17 с комплексом Rad9-1-1. Rad17 может замещать большую субъединицу комплекса RFC, образуя новый комплекс с малыми субъединицами RFC, обозначаемый Rad17– RFC. Комплекс Rad17– RFC функционирует как загрузчик зажима для Rad9-1-1 и таким образом указывает генам репарации на сайт повреждения. У дрожжей показано, что высокоошибочная низкопроцессивная полимераза DinB взаимодействует с белками Hus1Rad1, а их совместная ассоциация с хроматином является зависимой от Rad17.

15. Современные представления и знания о механизмах активации чекпойнтов и белках, вовлеченных в разные стадии этого процесса

   Повреждения, индуцированные в ДНК действием ионизирующей радиации, влияют на пути активации точек сверки (чекпойнтов), которые останавливают движение клетки в G1 и G2 фазах, и вызывает временную задержку в прохождении фазы S. Чекпойнты совместно с репарацией и апоптозом вовлечены в круговорот, который определяет основной ответ клетки на повреждение ДНК. Активация чекпойнт-ответа обычно включает сенсоры и медиаторы повреждений ДНК, переносчики сигнала и эффекторы. Вероятно, главную роль в чекпойнт-ответе играют белки ATR и ATM, а также CHK1 и CHK2-киназы. Также важна роль лежащих ниже эффекторов, таких как P53 и семейство белков-фосфатаз CDC25. Процессы репарации ДНК и геномной стабильности напрямую связаны с активацией чекпойнтов.

   Уже не менее 50 лет известно, что облучение вызывает задержку нормального прохождения клеток по циклу. Причем остановки происходят во всех фазах, хотя в G2 их легче всего обнаружить. Раньше эту задержку рассматривали как пассивный ответ клетки, причиной которого были повреждения в ДНК. Было очевидно, что в клетке инициируются особые процессы, помогающие облученным клеткам каким-то образом бороться с возникшими повреждениями и облегчить их репарацию. В 1980 году Пэйтнер с соавторами показали, что подобная задержка или крайне мала или полностью отсутствует в клетках больных АТ, которые в тоже время являются крайне чувствительными к ионизирующей радиации. Затем были выделены дрожжевые мутанты с повышенной чувствительностью к радиации и отсутствием задержки клеточного цикла. К настоящему времени стало понятно, что существуют механизмы «обзора» генома (genome-surveillance), обычно определяемые термином «чекпойнт повреждений ДНК» (DNA damage chekpoint), лишь одним из проявлений которого является задержка клеточного цикла. Современные научные представления допускают, что единство задержек, вызванных облучением на разных стадиях клеточного цикла, оказывается зависимым от активации отдельного чекпойнта повреждений ДНК.

   Параллельно изучались и последовательно выстраивались и сами процессы, необходимые для прохождения клеткой всех фаз клеточного цикла. К настоящему времени подтверждено, что клеточный цикл контролируется независимыми регуляторными переходами, которые приводят ДНК в состояние, способное к удвоению и клеточному делению. Эти переходы завершаются активацией циклин-зависимых киназ (CDKs), действием протеолитических путей и изменением состояния хроматина. CDKs являются основными компонентами белковой машины клеточного цикла и их активность строго регулируется несколькими независимыми путями, включая ассоциацию с соответствующими циклинами, фосфорелирование по определенным серин/треониновым или тирозиновым аминокислотным остаткам и связывание со специфическими белками-ингибиторами. Не удивительно, что CDKs являются также и одними из основных мишеней чекпойнт-ответа. Продвижение по клеточному циклу, опосредованное соответствующей белковой машиной, «проверяется» механизмами «обзора», который следит за тем, чтобы клетки не перешли в следующую фазу, пока все события предыдущей фазы не завершены. Эти механизмы «обзора», известные как чекпойнты клеточного цикла, являются идеологически (концептуально) отличными от чекпойнтов ДНК повреждений. Хотя наше современное знание о молекулярных механизмах различных чекпойнтов выявляет все большее их сходство.

   Подобно многим другим областям современной биологии, изучение чекпойнтов питается убеждением, что уточнение их молекулярных механизмов будет способствовать пониманию причин геномной нестабильности и рака, так как любой ген, вовлеченный в чекпойнты ДНК повреждений, важен для стабильности генома иили связан с наследственной предрасположенностью к раку. К тому же нарушение чекпойнт-контроля может быть отличительным признаком опухолевых клеток, поэтому большие усилия прикладываются для поиска агентов, которые могли бы сломать эти нарушенные чекпойнты. Подобные агенты можно было бы использовать в противоопухолевой терапии совместно с другими, например с облучением.