13.2. Убиквитин и убиквитин-связывающие белки

   Убиквитин – это крайне консервативный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков и обнаруженный во всех клетках. Он является основным кофактором АТФ-зависимой деградации белков.

   Рисунок 37. Убиквитинирование белков.

   При активации убиквитина его С-концевые лизины могут связаться с субстратом. Это происходит путем ковалентного связывания через е-NH2 группу лизина белка-субстрата, таким образом, что у большинства связанных с убиквитином белков С-конец одного убиквитина связывается с Lys48 следующего, образуя мультиубиквитиновые цепи. Белки, претерпевающие подобное убиквитинирование, преимущественно проходят деградацияю в составе 26S протеосом. Полиубиквитиновые цепи разбираются на отдельные молекулы собственными концевыми гидролазами. Эти ферменты образуют большое семейство и их роль до конца не ясна.

   Белки, связанные с убиквитином, можно разделить на три основные группы: активирующие (Е1), переносящие (связывающие) (Е2) и убиквитин-лигазы (Е3). Количество белков в каждой группе различно у разных видов. Например, у человека только один белок Е1, около 15 белков Е2, а Е3 – множество, причем самой разной структуры.

   Е2-белки содержат 16кд домен, лизины которого способны связывать и переносить убивитин на белки-субстраты. Сам перенос осуществляется убиквитин-лигазами Е3. Большинство из Е3 способны к образованию длинных убиквитиновых цепей, скорее всего, в комплексе с Е2 или друг с другом. Интересны несколько классов этих белков. Во-первых, это НЕСТ-домен-содержащие белки (НЕСТ-домен гомолог С-концевого домена онкогена Е6-АР, участвующего в деградации Р53 при вирусном заражении), которые важны для разворота РНК-полимеразы, а также участвуют в регуляции клеточного цикла и мембранных натриевых каналов. Другая группа Е3 – это белки АРС (anaphase-promoting complex). Еще одна убиквитин-лигаза SCF участвует в регуляции клеточного цикла совместно со специфической Е2 – Сdс34. Схема взаимодействия белков в процессе убиквитинрования показана на рис. 37. Гомологом убиквитина является белок SUMO, причем эта гомология затрагивает прежде всего четвертичную структуру, а не просто аминокислотную последовательность (там гомология всего около 20 %). Этот белок содержит такой же глициновый С-конец и способен связываться с субстратом по тому же принципу, что и убиквитин. SUMO взаимодействует с ядерным поровым комплексом, и связывание с ним белков-субстратов способствует их белковому импорту-экспорту из ядра, а не деградации.

   Вероятно, главная роль убиквитина и подобных ему белков состоит в «мечении» белков-субстратов и решения их дальнейшей судьбы, что играет ключевую роль во многих клеточных процессах.

13.3. Rad6-зависимая пострепликативная репарация

   Процесс пострепликативной репарации (PRR, post replication repair) у дрожжей называется еще Rad6-зависимой репарацией, так как была обнаружена группа белков, эпистатически связанных с Rad6 и вовлеченных в этот процесс. Rad6-зависимый путь PRR является эволюционно консервативным: у E.coli гомолог Rad6 вовлечен в процесс ресинтеза (рестарта репликации) при SOS-ответе, гомологи найдены у S.pombe и мыши, причем участвуют в сходных процессах обхода повреждения. Rad6-зависимый путь контролируется белками Rad6 и Rad18, образующими гетеродимер, способный к связыванию с ДНК и обладающий убиквитин-связывающей активностью.

   Гетеродимер Rad6/Rad18 и белок Rad5 необходимы для одного из путей пострепликативной репарации. Rad6 является классическим Е2-убиквитин-связывающим ферментом, образующим множество убиквитиновых цепей через связывание лизином в 48 положении. Rad18 является ДНК-связывающим белком с убиквитин-лигазной активностью. Комплекс Ubc13/Mms2 также является Е2-убиквитин-связывающим ферментом, но формирует убиквитиновые цепи через лизин в 63 положении. Rad5 является ДНК-связывающим белком, который привлекает комплекс Ubc13/Mms2 к ДНК, а также служит связующим звеном между комплексами Ubc13/Mms2 и Rad6/Rad18. Функции этих белков пока точно не определены, но их гомологи существуют и у млекопитающих. Rad6 имеет два гомолога в клетках человека, с которыми взаимодействует человеческий гомолог Rad18 (hRad18). Участие самого hRad18 в пострепликативной репарации доказано. Ген Mms2 считается частью безошибочного пути PRR, контролируемого Rad6, его продукт способен образовывать прочный комплекс с белком Ubc13, который в свою очередь способен к альтернативному убиквитинированию лизина в 63 положении.

   Белок Rad18 обладает способностью связываться с однонитевой ДНК, таким образом комплекс Rad6Rad18 способен связаться с остановившейся вилкой репликации, так как там имеется однонитевой «хвост». При этом Rad6 может убиквитинировать белки остановившегося комплекса репликации.

   Мутагенный путь пострепликативной репарации основан на способности полимераз семейства Y вести синтез на поврежденной матрице. Это процесс аналогичный SOS-репарации у прокариот. Вероятнее всего, убиквитинирование процессивной ДНК-полимеразы δ необходимо для ее деградации или перемещения, позволяющего полимеразам Y-семейства занять ее место и провести синтез на поврежденной матрице.

   Безошибочный путь пострепликативной репарации состоит из одного из вариантов синтеза на поврежденной матрице (Rad30-зависимого) и путей обхода повреждений, для которых необходимы белки Rad5, Mms2, Ubc13, Srs2, а также ДНК-полимераза-δ, PCNA и некоторые белки гомологической рекомбинации. Схема этого процесса предложена на рис. 38.

   О низкопроцессивных ДНК-полимеразах эукариот, участвующих в процессе «прохода» повреждении, мы уже подробно говорили при изучении SOS-ответа у E.coli.

   Rad5 является членом семейства SWI/SNF, как и CSA, обладая АТФазной активностью. Он может способствовать ремоделированию хроматина и помогать белкам репарации подойти к ДНК, а также участвовать в переключении матрицы при остановке вилки репликации. Это делает его одним из главных игроков.

   PCNA может быть моноубиквитинирован Rad6 и Rad18, полиубиквитинирован Rad6, Rad18, Rad5, Mms2, Ubc13, и «сумоирован» Ubc9, что играет важную роль в выборе субпути Rad6– зависимой PRR. Таким образом различные модификации PCNA могут определять тот тип репарации, который будет использован при ресинтезе (рестарте репликации). Связаны ли модификации PCNA с внутри S-фазными чекпойнт-функциями не ясно.

   Ген Srs2 является гомологом ДНК-геликазы UvrD E.coli и проявляет антирекомбинационную активность, антагонистическую активности Rad51 – то есть он способен разрушать его активные филаменты. Интересно, что Srs2 способен взаимодействовать с pol32 – субъединицей ДНК-полимеразы-δ. Во время чек-пойнт ответа на повреждение ДНК Srs2 может быть фосфорелирован Mec1 и Rad53 —киназами. Именно этот белок может быть мишенью чек-пойнт-киназ в комплексе белков остановившейся вилки репликации внутри S-фазы. Вероятно, у него есть еще дополнительные функции вне PRR. В то же время Srs2, Mec1и Rad5 могут кооперироваться в осуществлении независимого от рекомбинации Ресинтеза (рестарта репликации). Таким образом, выбор субпути может также зависеть от регуляции клеточного цикла – то есть от чекпойнт-ответа.

   Рисунок 38. Два пути пострепликативной репарации у эукариот.

   Возможно, что сам Rad51 является ингибитором однонитевого отжига по прямым повторам (вытесняя Rad52). Вероятно, Rad51-зависимую рекомбинацию можно считать репликацией, индуцированной разрывами. Мишенью для Rad51 могут служить не только однонитевые бреши, но и отожженные друг на друге вновь синтезированные сестринские хроматиды остановившейся вилки репликации, так как там есть двунитевые концы, или просто разрушающаяся вилка с двойными концами ДНК.

   Роль чекпойнт-сигналов и привлечения факторов репарации в процессах пострепликативной репарации до конца неясно.