10. Защитники генома
10.1. Защитники генома. Белок р53
Многократно упоминаемый ранее белок Р53 играет большую роль в репарации двунитевых разрывов и может влиять на выбор пути репарации между HHR и NHEJ. Многофакторная роль белка Р53 в репарации, контроле клеточного цикла и апоптозе делает крайне сложным выделение именно роли в репарации DSBs. Было показано, что Р53 способен связываться как с однонитевой так и с двунитевой ДНК в том месте, где происходит нуклеазная 3’-5’ расчистка и способствует отжигу гомологов. Так же он способен связываться с мисмэтчами и трехнитевыми структурами, а также с холлидеевскими структурами, способствуя их разрешению. При этом он связывается с комплексами BRCA2 с WRN и BLM, регулируя геликазные активности WRN и BLM.
Как уже говорилось, в условиях нормального функционирования в клетке содержание и активность р53 невелики. Хотя в некоторых типах клеток содержание р53 и может быть заметным, он находится в неактивной латентной форме. Латентная форма р53 лишена способности активировать транскрипцию р53-респонсивных генов. Это не означает, однако, что, находясь в латентной форме, р53 полностью лишен какой-либо активности. Возможно, в такой форме он играет какую-то роль именно в процессах репарации ДНК. В частности, было обнаружено, что латентная форма р53, лишенная способности связываться с ДНК, может узнавать участки одноцепочечной ДНК, неспаренные основания, а также имеет повышенную 3'-5'-экзонуклеазную активность. Напротив, активированная форма р53 утрачивает экзонуклеазную активность, но приобретает способность связываться с ДНК.
Активация гена р53 происходит под действием повреждения ДНК. При этом, несмотря на то, что в регуляторной области промотора гена р53 имеются участки связывания некоторых транскрипционных факторов, изменения транскрипции самого гена р53 происходят редко. Существенная активация гена р53 на транскрипционном уровне известна только для ранних эмбрионов, а также для недифференцированных эмбриональных тератокарцином, где уровень мРНК р53 повышен на порядок по сравнению с клетками взрослого организма.
Накопление р53 в ответ на стрессы происходит даже в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка, что говорит о его послетрансляционном характере. При этом происходит значительная стабилизация р53.
Кроме количественного накопления р53 происходят также глубокие качественные изменения белковой молекулы, сопровождающиеся ее переходом от латентного в функционально-активное состояние. Эти изменения происходят за счет фосфорилирования, дефосфорилирования, ацетилирования, метилирования и гликозилирования различных участков белковой молекулы, а также за счет образования ковалентных и нековалентных комплексов с другими белками. Многообразие участков модификации и факторов, взаимодействующих с р53, обеспечивает тонкую регуляцию его активности. Активация р53 не является необратимой, поскольку имеются механизмы обратной связи, позволяющие вернуть р53 в менее активное или латентное состояние после преодоления дефектов и сбоев в работе клетки.
Основное фосфорелирование белка Р53 по серину в 15 положении проводит белок АТМ. Вероятно, в этом процессе каким-то образом участвует и белок BARD1, способствуя этой стабилизации.
Для функционирования р53 как фактора транскрипции требуется его взаимодействие с ДНК. Модификация С-концевой части молекулы, индуцируемая разнообразными стрессовыми механизмами, сопровождается конформационной перестройкой и приобретением белком способности связываться с ДНК. Но для начала транскрипции требуется сложное взаимодействие N-концевой транскрипционно-активаторной части р53 с компонентами транскрипционного аппарата – белками комплекса TFIID – ТВР (ТАТА-Вох Binding Protein) и ТВР-ассоциированными факторами TAFII. Небольшой гидрофобный участок р53 вокруг Leu-22 и Тгр-23 отвечает за взаимодействие сразу с несколькими белками транскрипционного аппарата. Кроме того, для активации специфических промоторов в комплексе с TFIID должны присутствовать транскрипционные коактиваторы – CREB-binding protein (СВР) и близкородственный ему белок рЗОО. рЗОО/СВР обладает гистон-ацетил-трансферазной активностью. Ацетилирование гистонов играет важную роль в модуляции структуры хроматина при активации транскрипции, увеличивая доступность хроматина для транскрипционного аппарата. рЗОО/СВР способен напрямую взаимодействовать с комплексом РНК-полимеразы II и таким образом служить проводником, обеспечивающим инициацию транскрипции в ответ на связывание транскрипционного фактора. N-Концевой трансактивационный домен р53 также взаимодействует с рЗОО/СВР.
Некоторые сигналы, например, γ-излучение, приводят к стабилизации белка Р53 с одновременным увеличением уровня белка Р53 в устойчивом состоянии. В клетках больных АТ нарушен путь регуляции «сверху» этого процесса (нет фосфорелирования белка Р53 протеинкиназой АТМ), что приводит к отсутствию стабилизации Р53 и остановки клеточного роста в ответ на радиационные повреждения ДНК. В негативном пути регуляции повышение уровня Р53 приводит через взаимодействие с ТВР к супрессии транскрипции генов, усиливающих рост клеток, что ведет к ингибированию пролиферации. Мутантный Р53 не может супрессировать транскрипцию и таким образом ингибировать экспрессию генов, отвечающих за клеточный рост, которые поддерживают пролиферацию. В позитивном регуляторном пути повышение уровня белка Р53 дикого типа приводит к стимуляции транскрипции генов, которые вовлечены в процессы репарации ДНК и тех, которые негативно регулируют клеточный рост, что приводит к остановке клеточного цикла в фазе G1.
На рис. 33 изображено, как именно может работать Р53 в качестве антионкогена.
Продукт гена mdm2 является клеточным регулятором функций Р53 дикого типа и находится под его положительным контролем. Возрастание уровня MDM2 действует по принципу отрицательной обратной связи на возросший уровень Р53 в системе авторегуляции этого белка, которая при вовлечении белка Р53 в комплекс с MDM2 способна снять блок с продвижения клетки по циклу. Увеличение экспрессии MDM2 из-за разрегулирования экспрессии или в результате амплификации может приводить к опухолеобразованию. К тому же многие продукты ДНК онковирусов, например полноразмерный антиген вируса SV-40, 55кд белок аденовируса Е1В и продукт гена папилломы человека Е6 ингибируют трансактивацию белка Р53 дикого типа и, блокируя таким образом функции Р53, могут частично способствовать канцерогенезу. Другие сигналы также могут влиять на клеточный рост и опухолеобразование через посредство Р53 дикого типа. Например, продукт гена аденовирус Е1А индуцирует апоптоз в клетках с Р53 дикого типа. Ингибирование активности Р53 с помощью котрансфекции Е1А и Е1В запрещает апоптоз и способствует трансформации. И. наконец, неправильные ДНК-интермедиаты и структуры могут повысить уровень Р53 дикого типа и привести к апоптозу, убирающему поврежденные клетки, или остановке клеточного роста, если ДНК не может быть отрепарирована.
Рисунок 33. Схема работы белка Р53.
Эти механизмы действуют как защитники генома и противостоят преобразованию нормальных клеток в опухолевые. Потеря функции Р53 дикого типа в результате мутаций, образования комплексов с продуктами онкогенных вирусов или с клеточными негативными регуляторами, или изменения его внутриклеточной локализации приводит к утере защитных свойств и способствует развитию онкологических заболеваний. Вероятно, Р53 способен также контролировать RAD51-зависимую гомологичную рекомбинацию, которая может быть одной из причин возникновения хромосомных перестроек в ходе развития опухоли. К настоящему времени сложилось представление, что белки BRCAl, BRCA2 и P53 являются составляющими единого репарационного ядерного комплекса, а различные белок-белковые взаимодействия связаны с регуляцией активности этого комплекса.
Наличие наследственного гетерозиготного носительства мутаций, инактивирующих Р53 приводят к развитию синдрома Ли-Фромени, характеризующегося семейными формами рака различной этиологии.