9.3.3.3. Геликазы семейства RecQ
Обсуждая роль рекомбинации в стабильности клеточного генома, нельзя обойти вниманием и участие в этих процессах геликаз семейства RecQ.
Гомологи геликазы RecQ из Е. coli обнаружены практически у всех организмов. Их строение показано на рис. 30.
RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III играют важную роль не только в гомологической рекомбинации, но и в других клетчных процессах, таких как репликация и контроль клеточного цикла. Как уже говорилось, именно RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III способны проводить требующие топологических изменений ДНК некросссоверные разрешения Холлидеевской структуры. Такое разрешение процессов митоточеской рекомбинации у высших эукариот позволяет избежать возникновения разрывов в донорной ДНК и таким образом не допустить хромосомных перестроек в случае если в пороцесс гомологической рекомбинации будут вовлечены некгомологичные хромосомы или негомологичные участки гомологичных хромосом.
У человека в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК крайне важны белки WRN и BLM, которые также являются гомологами RecQ-геликазы E.coli, и связаны с развитием таких тяжелых синдромов, как синдром Вернера (ускоренное старение взрослых) и синдром Блюма соответственно. Оба эти синдрома характеризуются признаками ускоренного старения и повышенным риском опухолеобразования. Дефект другой RecQ-подобной геликазы – RecQ4 – приводит к развитию еще одного крайне редкого заболевания – синдрома Расмунда-Томсона.
Рисунок 30. Сравнительное строение RecQ-подобных геликаз у различных видов.
9.3.3.4. Синдром Блюма
Больные, страдающие синдромом Блюма (BS) характеризуются крайне малым весом при рождении и остановкой роста, мужским гипогонадизмом, сниженной фертильностью и ранней менопаузой у женщин, предрасположенностью к диабету и новообразованиям. На лице под воздействием света развивается характерная телеангиэктазия в форме "бабочки", голова больных удлинена, у них резко снижен иммунитет и они легко подвержены инфекциям. В основной популяции больные BS крайне редки, но в популяции евреев-ашкенази частота заболевания достигает 1: 58 000. Эта болезнь является аутосомным рецессивным заболеванием. Исследования клеточных штаммов от пациентов с BS показали, что у них существенно длинее, чем в нормальных клетках время клеточного цикла, при этом за одно и тоже время клетки BS способны синтезировать вдвое меньше ДНК, чем контрольные и удлинение вновь синтезированной нити ДНК происходит медленнее. Накапливающиеся же промежуточные продукты репликации имеют размер 20кБ, что достоверно больше, чем фрагменты Оказаки. При этом клетки BS сохраняют нормальный уровень ДНК-полимераз.
В клетках BS в культуре наблюдается большое количество спонтанных разрывов и перестроек и повышенный уровень соматической рекомбинации. Очень высоко количество особых хромосомных аберраций – квадрирадиальных фигур, названных так за то, что хромосомы располагаются в них в четырех направлениях.
В клетках BS наблюдается также повышенный уровень спонтанных мутаций, причем этот эффект затрагивает как кодирующие участки ДНК, так и некодирующие повторы (т. е. транскрибируемую и нетранскрибируемую ДНК в равной степени).
В 1993-94 годах ген синдрома Блюма был картирован и сиквенированием и получил название BLM (Bloom-mutated). Он расположен на 15 хромосоме – 15q26.1 и кодирует белок в 1417 аминокислот с молекулярной массой 159 кД. При изучении этого белка была обнаружена его гомология с тремя уже известными геликазами. Участок 649-1041 содержит семь консервативных геликазных доменов идентичных аналогичным участкам человеческого RесQL (44 %), Saccharomyces cerevisia SGS1 (43 %) и Escherichia coli RecQ (42 %) белков. Все эти белки относятся к RесQ-геликазам. RесQ-белок Е. coli обладает ДНК-зависимой АТФ-азной и ДНК-геликазной активностями и может перемещать однонитевую ДНК в направлении 3'-5'. Также он вовлечен в пострепликативную репарацию УФ-повреждений. Дрожжевой белок SGS1 способен к взаимодействию с дрожжевыми Top2p и Top3p топоизомеразами. Продукт человеческого гена RесQL, выделенного из клеток HeLa, проявляет ДНК-зависимую АТФ-азную, ДНК-геликазную активности, а также способность к 3'-5' ДНК транслокациям. По аналогии BLM должен также обладать подобными свойствами.
В области 588–661 также были обнаружены три коротких мотива, подобных тем, которые описаны среди филогенетического многообразия большой субъединицы РНК полимеразы II. Роль этих мотивов неясна. Никакой другой гомологии в описанной аминокислотной последовательности не обнаружено, хотя негеликазные участки также имеют необычную структуру. В них очень много кислых, основных и полярных аминокислот, причем 13 % N-концевой последовательности и 14 % C-концевой составляют остатки серина. Функция столь сложных частей описанного белка остается пока неизвестной. Хотя возможно сделать несколько предположений. Эта негеликазная часть белка BLM близка по составу к негеликазной части уже упомянутого нами дрожжевого белка Sgs1 – самого близкого к BLM и по размеру. Мутанты по этому гену характеризуются медленным ростом, нерасхождением хромосом в митозе и ошибками их сегрегации в мейозе, а также повышенной частотой рекомбинации. Повышенная частота хромосомных перестроек, нарушение репликации и пониженная топоизомеразная активность характерны и для клеток больных BS. Можно предположить, что негеликазная часть этих белков связана именно с поддержанием стабильности хромосом в клетке.
При анализе последовательностей BLM от 10 различных клеточных линий BS было обнаружено 7 мутаций, четыре из которых приводили к остановке синтеза мРНК и образованию укороченной формы белка в 185, 271, 515 и 739 аминокислот, то есть без геликазной области. Причем последняя из этих мутаций наблюдалась у всех (в данном исследовании их было 4) пациентов евреев-ашкенази. Было высказано предположение, что почти все больные синдромом Блюма в популяции евреев-ашкенази несут одну и ту же мутацию. Еще две миссенс мутации обнаружены в консервативной области гомологичной RесQ и одна замена цистеина на серин в С-конце. Не совсем ясно, каким образом подобная мутация приводит к появлению BS фенотипа. При этом можно предположить, что белок BLM не является необходимым для сохранения жизни индивидуума, так как у больных этот белок полностью инактивирован. Вероятно, какие-то другие факторы в клетке способны частично замещать утерянную BLM активность.
BLM фосфорелируется белком ATM, он играет важную роль в разрешении холидеевской структуры и способен связываться с RAD51 и с BRCA1, входя в состав так называемого BASC (BRCA1 associated genom surveiiance complex) – комплекса, по современным представлениям являющегося сенсором повреждений генома.