9.3.3. Болезни, связанные с дефектами генов, вовлеченных в репарацию двунитевых разрывов

   К сожалению, как и в случаях MMR и NER, мутации некоторых генов, участвующих в репарации DSBs, приводят к развитию различных наследственных синдромов. Все они характеризуются повышенной клеточной чувствительностью к действию γ-облучения и химических мутагенов и высоким риском развития онкологических заболеваний.

   При описании процесса NHEJ мы уже упоминали тяжелый наследственный синдром иммунодефицита, развивающийся при мутациях гена, кодирующего нуклеазу Artemis. Синдромы повышенной радиочувствительности развиваются и в случаях мутаций в других генах, связанных с процессами нуклеазной расчистки места разрыва – RAD50 (ATLD, AT like disease), NBS1 (Нийменгенский синдром ломкости хромосом) и NHEJ – ligIV (ligIV syndrome).

   Кроме ATM в передаче сигнала участвует и другая протеинкиназа из семейсва PI3-киназ (фосфоинозитол-3-киназы) – ATR (ataxia-telangiectasia related), сходная с ней по структуре и хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе. Только в 2003 году было показано, что нарушение репарации ДНК у больных синдромом Секеля, характеризующегося повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации, связано с мутацией, инактивирующей ген АТR. ATR включается несколько позднее, пик ее активности наступает через 2–4 часа после повреждения ДНК. При отсутствии АТМ ATR частично берет на себя ее функции. Недавно показано, что ATR образует гетеродимер со специфическим белком ATRIP (ATR interacting protein), что важно для чекпойнт-сигнала, хотя механизм этого влияния остается неизвестным.

   Но есть целая группа хорошо изученных заболеваний, от которых страдает достаточно большое число пациентов, при которых мутации несут гены, вовлеченные в процессы гомологической рекомбинации и глобальный клеточный ответ на повреждения ДНК. Эти заболевания мы рассмотрим более подробно, так как основанные на них клеточные модели позволили разобраться в деталях многих процессов.

9.3.3.1. Атаксия-телеангиэктазия. Белок атм

   Тяжелое наследственное заболевание атаксии-телеангиэктазии (АТ) или синдром Луи-Бар характеризуется расстройством движения (атаксией), расширенмием капилляров кожи и роговицы (телеангиэктазией), врожденным иммунодефицитом, нейродегенеративными изменениями, чувствительностью к ионизирующему излучению, резко повышенной предрасположенностью к опухолевым заболеваниям и ускоренным старением. Это заболевание очень подробно описано и является одним из «синдромов нестабильности генома» В различных человечечких популяциях АТ встречается с частотой от 1:40 000 до 1: 200 000 рождений. Гетерозиготное носительство этого заболевания распространено гораздо шире – по различным данным от 2 % до 8 % населения несут мутации, приводящие к АТ, в гетерозиготном состоянии. К тому же это гетерозиготное носительство также, как и сама АТ сопряжено с повышенным риском новообразований.

   Традиционно сложилось представление о том, что повышенная чувствительность АТ– клеток к радиации является прямым результатом дефекта репарации повреждений, вызываемых ионизирующей радиацией. Это было самым распространенным объяснением этиологии данного заболевания. Но многочисленные исследования не обнаружили достоверного изменения кинетики ликвидации как одно– так и двунитевых разрывов ДНК в клетках больных АТ по сравнению со здоровыми донорами после облучения. При этом большинство, если не все изученные штаммы клеток АТ, имеют сниженный и растянутый по времени репаративный синтез ДНК после действия ионизирующей радиации.

   Долгое время при изучении АТ основным оставалось, основанное на выявленных методом изучения внепланового синтеза ДНК четырех группах комплементации, представление о существовании четырех различных генов. Прогресс в этой области был крайне медленным, несмотря на ярко выраженный клеточный фенотип, который использовали для получения коплементирующей ДНК. Но в 1995 году наконец-то было доказано, что у всех больных АТ поврежден один и тот же ген АТМ, картированный на 11 хромосоме (11q22-23). Этот научный прорыв резко ускорил изучение атаксии-телеангиэктазии. Особенно интересным оказался С-концевой домен белка АТМ, содержащей 400 аминокислот. Эта область показывает явное соответствие сиквенсу домена 100кД каталитической субъединицы особого белка – сигнального переносчика-медиатора – фосфатидилинозитол-3' киназы (PI-3 киназы) человеческих клеток и соответствующего ей дрожжевого белка Vps34.

   Ген АТМ кодирует белок с молекулярным весом 350.6 кД, содержащий 66 экзонов. Это открытие подтвердило наличие только одного гена АТМ и показало, что описанные ранее различные группы комплементации АТ являются артефактом и свидетельствуют только о большом индивидуальном разнообразии данного заболевания на клеточном уровне. К настоящему времени обнаружено около 80 мутаций, приводящих к инактивации гена АТМ и развитию у пациентов атаксии-телеангиэктазии, и несколько меньшее число характерных для различных популяций полиморфизмов, не влияющих на активность белка АТМ. Таким образом к настоящему времени сложилось представление о том, что высокая вариабельность степени выраженности различных клинических признаков атаксии-телеангиэктазии все же основана на мутациях в одном гене, продукт которого вовлечен во множество белок-белковых взаимодействий. Именно от этих взаимодействий и зависит характер и тяжесть заболевания в каждом конкретном случае.

   К настоящему времени сложилась следующая картина, описывающая роль АТМ в клетке. Протеинкиназа АТМ является переносчиком сигнала на начальном этапе клеточного ответа на появление двунитевых разрывов ДНК. Она действует с самых первых минут после повреждения, фосфорелируя целый спектр белков-мишеней и запуская таким образом сразу несколько различных сигнальных путей. Преимущественная активация того или иного пути и приводит к различному протеканию репарационных процессов в клетке. Пик АТМ-зависимого ответа наступает через полчаса после действия повреждающего агента.

   Рисунок 27. Белки – мишени пртеинкиназы АТМ

   До сих пор не совсем ясно, каким образом активируется сама АТМ, обычно находящаяся в клетке в неактивной гомодимерной форме. При появлении двунитевых разрывов ДНК две молекулы АТМ взаимно фосфорелируются и гомодимер распадается на две активные протеинкиназы. Не ясно до конца и то, каким именно образом гомодимер ATM воспринимает сигнал о повреждении ДНК. Вероятно, неактивная АТМ связывается с белками системы репарации неспаренных оснований MSH2 и MSH6. Можно предположить, что система MMR распознает повреждения, вызванные ионизирующей радиацией, образуя молекулярные «строительные леса», которые позвляют АТМ фосфорелировать СНК2, активируя таким образом чек-пойнт S-фазы. То есть для быстрой реакции АТМ на облучение необходима и нормальная активность системы MMR. Вероятнее всего, прямого взаимодействия АТМ с ДНК нет. Она фосфорелирует гистон Н2АХ, что привлекает белки BRCA1 и NBS1 (являющийся частью комплекса MRN и прямой мишенью АТМ, то есть главным переносчиком сигнала с АТМ на MRN), которые АТМ также фосфорелирует. Основные мишени АТМ показаны на рис. 27. Существующие данные утверждают, что именно АТМ определяет ранний чекпойнт-ответ, а ATR действует позднее, когда уже идет репарация повреждений ДНК, как вызванных ионизирующей радиацией, так и ультрафиолетовым изличением или остановкой вилок репликации

   Регуляторная роль АТМ в передаче сигналов в клетке после действия ионизирущей радиации крайне высока. В зависимости от того, какой именно белок Ku70 или АТМ будет действовать в первые минуты после образования двунитевого разрыва будет осуществляться тот или иной путь воссоединения концов (NHEJ или HHR соответственно). То есть АТМ контролирует именно путь воссоединения двунитевых разрывов с помощью гомологической рекомбинации.