5.2.1. Функциональные гены-гомологи у про– и эукариот
Поиск гомологичных генов привел к выявлению по меньшей мере двойного набора гомологов генов mutS и mutL у S. cerevisiae и человека, что легло в основу предположения о гетеродимерной структуре гомологов белков MutS и MutL у эукариот. Эти гомологи представлены в табл. 3. Распознавание мисмэтчей или модифицированных оснований у эукариот осуществляется комплексом MutSα, который связывается с повреждением. Он состоит из белков-гомолгов MutS E.coli MSH2 и MSH6 (также описанный под названием GT-связывающий белок – GTBP). Для эффективного связывания необходимо фосфорилирование комплекса MutSα. Особенностью комплекса MutSα у S. cerevisiae (MSH2 + MSH6) является его асимметрия – наличие главной и дополнительной составляющих. Действительно, мутации msh6 в отличие от msh2 показывают как слабый мутаторный фенотип, так и слабое подавление репарации инсерционно-делеционного типа. Это не исключает возможности существования комплексов белка MSH2 с другими составляющими. Именно такая ситуация имеет место в клетках человека, которые содержат два MutS-подобных комплекса, hMutSa (hMSH2 + hMSH6) и hMutSβ (hMSH2 + hMSH3), причем с разным спектром опознаваемых повреждений. Разные комплексы имеют разные мишени для связывания – MutSα способен связаться как с неправильно спаренными основаниями, так и с инсерциями/делециями, приводящими к неправильному спариванию и выпетливанию ДНК. MutSβ же способен связаться только с инсерционно-делеционными мисмэтчами и особо эффективен в случае петель, включающих 2–3 основания.
Несколько другая схема MMR у эукариот показана на рис. 10. До сих пор недостаточно ясно, как именно MMR у эукариот различает матричную и дочернюю нити. Предполагается, что в дочерней нити остаются недолигированные однонитевые разрывы (бреши), образовавшиеся во время репликации. На рис. 10А показано, что дискриминация нити происходит именно с использованием этих недолигированных брешей; всегда в течение какого-то времени сохраняющихся в новосинтезированной нити. Проблема в том, что такой разрыв и мисмэтч могут отстоять друг от друга на большое расстояние. Как же тогда MutSα может одновременно их распознать?
Тут нужно остановиться на роли АТФ в процессе MMR. Оба белка (MSH2 и MHS6) содержат АТФАДФ-связывающие сайты. Мутации в этих сайтах приводят к нарушению процесса MMR, но не влияют на GT-связывание. Пространственная модель этого связывания представлена на рис. 10Б. В настоящее время существуют две модели, объясняющие роль АТФАДФ в MMR. В модели «молекулярного переключения» (molecular switch model), которая базируется на реакциях АТФАДФ связывании и гидролиза АТФ, предполагается, что MutSα/АДФ комплекс отвечает за распознавание и связывание с мисмэтчем («активное состояние»). Связывание с мисмэтчем запускает реакцию АДФ→АТФ и стимулирует собственную АТФ-азную активность MutSα, приводящую к его конформационным изменениям, с образованием независимого от гидролиза АТФ «скользящего зажима». Этот «скользящий зажим» пассивно диффундирует от мисмэтча и подает сигнал на диссоциацию белков MMR от ДНК («неактивное состояние»). В этой модели гидролиз АТФ на MutSα вызывает конформационные изменения и таким образом способствует связыванию MutLα. К тому же диссоциация MutSα от ДНК зависит от связывания АТФ, но не от его гидролиза.
Рисунок 10. Процесс MMR у эукариот. А – схема последовательности реакций, Б – связывание гетеродимера MutSα с ДНК.
В другой модели, называемой «гидролиз-зависимой моделью перемещения» (hydrolysis-driven translocation model) MutSα использует энергию гидролиза АТФ для того, чтобы перемещаться вдоль ДНК от сайта распознавания мисмэтча к сайту, ответственному за сигнал о нитеспецифичности (чаще всего, однонитевому разрыву). Соединение с MutLα-комплексом происходит именно в этом сигнальном сайте.
Гетеродимер образуется и в структуре MutL-подобных комплексов эукарнот: MLHl + PMSl – у дрожжей и MLHl + PMS2 – у человека. У человека выявлен еще и третий гомолог– ген hPMSl. Таким образом после связывания с мисмэтчем MutSα ассоциируется с комплексом MutLα, состоящим из гомологов гена Е. сoli MutL – MLH1 и PMS2. Эксцизию ДНК, содержащей неправильно спарившееся основание осуществляет экзонуклеаза I, а новый синтез – ДНК-полимераза-δ. Вероятно, у высших эукариот в этой системе репарации принимает участие и белок PCNA, так как у MSH2 и MLH1 есть специфические сайты, связывания с ним.
Является ли процесс MMR индуцибельным, до сих пор не ясно. Промотор гена, кодирующего MSH2, имеет сайт связывания с белком Р53 и его индукция была показана при котрансфекции Р53 и онкогенов fos/jun. Обработка клеток алкилирующими агентами, например метил-нитро-нитроз-гуанидином (MNNG) приводит к повышению мисмэтч связывающей активности комплекса MSH2/MSH6 и его перемещению внутри ядра. Вероятно, регуляция активности MMR происходит как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.
Таким образом мы видим, что картина репарационных событий в системе MMR у эукариот подобна той, которая была выявлена у прокариот. При этом функции MutS– и MutL-подобных гетеродимсрпых комплексов аналогичны описанным для системы MutHSLU бактерий. Но по количеству структурных и регуляторных элементов она, безусловно, является более сложной. Биологические функции системы MMR у эукариот, безусловно, шире, чем у прокариот. Эта система является барьером для внутрихромосомных рекомбинационных перестроек, возможных из-за существования в геноме высших эукариот множественных повторов (в клетках млекопитающих внутрихромосомная рекомбинация значительно более чувствительна к совершенству гомологии взаимодействующих участков ДНК, чем межхромосомная).
Таблица 3. Функциональные гены-гомологи системы MMR у про– и эукариот
К тому же существует множество данных о том, что белки MSH2, MSH6 и MLH1 принимают непосредственное участие в других репарационных процессах – эксцизионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, репарации двунитевых разрывов и генерации и передаче сигнала о повреждении ДНК (об этом мы будем подробнее говорить при изучении репарации двунитевых разрывов).
Как видно из табл. 3, гомологов белка MutH у эукариот не обнаружено. Это связано с принципиально иным типом различения родительской и вновь синтезированной нитей ДНК.
Сравнительное изучение системы MMR у человека имеет большое медико-биологическое значение. Это подтверждается наличием таких наследственных заболеваний человека, как семейная форма неполипозного рака прямой кишки (HNPCC).
Неполипозный рак толстого кишечника (ННРТК, HNPCC – human non polyposis colon cancer), который составляет, по разным оценкам, от 5 % до 15 % всех регистрируемых случаев колоректального рака, сопряжены, главным образом, с повреждениями трех генов – hMLHI (49 %), hMSH2.(45 %) и hPMS2 (6 %). К настоящему времени выявлено до 40 мутаций в каждом из первых двух генов и небольшое число мутаций в других генах, включая hPMS2 и hPMSI. Складывается также и генетическая картина перехода от предрасположенности к развитию заболевания в результате инактивации обоих аллелей одного из этих генов системы MMR.
В то же время среди спорадических раковых опухолей различной локализации от 10 % до 30 % имеют нестабильную структуру микросателлитной ДНК, так называемый фенотип RER+ (replication error). Эта нестабильность возникает в результате неисправленной ошибки репликации, что автоматически подразумевает существование дефекта в системе MMR. Результаты исследований клеточных линий, происходящих из раковых клеток с фенотипом RER+, показывают, что они несут мутации в генах hMSH2, hMLHI, hPMS2 и GTPB.
Что касается VSPMR, то у эукариот тоже выявлена система специализированного исправления G-T на G: C, но она не сопряжена с MutS– или MutL-noдобными белками. Вероятно, в этом случае используется специализированная гликозилаза, удаляющей Т из пары G-T (то есть функции этого пути MMR E.coli. у высших эукариот берет на себя BER).