5.1.1. Многочисленные возможности репарации 8-оксигуанина
В целом, BER – чрезвычайно действенный барьер мутациям оснований. Ярким примером этого является тройная система защиты ДНК от окисления гуанинов, выявленная как у Е. сoli, так и у высших эукариот, включая человека.
Известно, что окислению может подвергаться не только уже встроенные в цепь ДНК нуклеотиды, но и их предшественники. Окисление dGTP приводит к образованию 8-окси-dСТР, но клетка содержит специализированную dGTPaзy – белок MutT, обладающий повышенным сродством к 8-окси-dGTP. Этот белок гидролизует 8-окси-dGTP до 8-окси-dGMP, удаляя его из пула нуклеотидов и предотвращая его встраивание во вновь синтезируемую ДНК. Таким образом MutT E.coli и МТН1 (Mut T homologue 1) человека являются крайне интересными белками, не вовлеченных напрямую в эксцизионную репарацию оснований, но существенно снижающими уровень оксипуринов в ДНК.
Если же модифицированный предшественник 8-оксиG все же внедряется в ДНК напротив С, то такая неправильная пара опознается гликозилазой MutM E.coli (Fpg, OGG1 соответственно у дрожжей и человека), которая может удалить 8-оксиG, встроившийся напротив С, из ДНК.
Если и этого до начала репликации ДНК не произошло, то в ходе нее 8-оксиG может попытаться спариться с А. Такая пара распознается гликозилазой MutY E.coli (гомолог эндонуклеазы III, выщепляющей из ДНК тиминовые гликоли, цитозиновые гидраты и другие повреждения). Эта гликозилаза обладает лиазной активностью, удаляет А из ДНК и вносит разрыв в сахарофосфатный остов. Также она распознает пары G-C и A-G. У человека эту функцию выполняет специализированная гликозилаза MYH (Mut Y homologue).
Говоря о взаимосвязи между собой в процессе защиты ДНК от встраивания 8-оксоG нескольких параллельных путей эксцизионной репарации оснований, необходимо добавить, что механизмы репарации, участвующие в удалении из поврежденной ДНК 8-оксо-G были исследованы in vitro, то есть на бесклеточных экстрактах очищенных белков. Было обнаружено, что из транскрибируемой части ДНК 8-окси-G удаляется быстрее, чем из нетранскрибируемой. Гликозилазой, необходимой для инцизии 8-окси-G и использованной в этих опытах, была Ogg1. Таким образом, по крайней мере для одной из гликозилаз, четко показано, что при BER наблюдается преимущественное выщепление поврежденного основания из транскрибиремой ДНК, то есть тот путь BER, который начинает специализированная гликозилаза Ogg1 может быть описан как зксцизионная репарация оснований, спаренная с транскрипцией.
5.1.2. Роль pcna в эксцизионной репарации оснований
Хотелось бы отдельно остановиться она роли PCNA в процессах репарации.
Как уже говорилось, у высших эукариот эксцизионная репарация оснований протекает двумя альтернативными путями – с коротким и длинным ресинтезируемыми фрагментами. Их еще иногда называют ДНК-полимераза-β-зависимый и PCNA-зависимый пути.
PCNA-зависимый путь репарации АР-сайтов был совсем недавно реконструирован in vitro с участием АР-эндонуклеазы (АРЕ1), RFC, PCNA, FEN1, ДНК-полимеразы– δ и ДНК-лигазы I. При репарационной реакции в этой реконструированной системе преимущественно замещаются два нуклеотида. PCNA является обязательным участником этой системы и подавление его активности специфическими антителами приводит к ингибированию репарации АР-сайтов в клеточных экстрактах млекопитающих.
У дрожжей показано, что некоторые мутации в гене PCNA приводят к резкому снижению репарации после действия MMS (метил-метан-сульфоната, очень сильного мутагена), не затрагивая при этом их ростовой активности. К настоящему времени сложилось представление, что у дрожжей все пути BER PCNA-завимые.
Таким образом, polβ в процессе BER принимает участие и в PCNA-зависимом и в PCNA-независимом (polβ—завимом) путях. PCNA-зависимых путей тоже 2 – в первом из них вставляется 2 нуклеотида, а в другом – около 10–12 нуклеотидов. Может быть, это связано с тем, какая из полимераз – δ или ε будут использованы при этом, но прямых данных об этом нет, так как в системе in vitro замена одной на другую на уровень репарации не влияла.
Установлено, что PCNA может напрямую взаимодействовать с большой субъединицей RFC (состоящего из 5 субъединиц), экзонуклеазой FEN1, ДНК-полимеразой-δ (третья субъединица) и ДНК-лигазой I. Это взаимодействие происходит благодаря наличию во всех этих белках консервативного мотива QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y), содержащего 8 аминокислотных остатков. Наличие этого мотива в различных белках представлено на рис. 7. PCNA служит молекулярным адаптером для привлечения всех этих белков в зону репаративной реакции. Данный мотив был обнаружен и у достаточно большого числа других белков – MSH2, MLH1 (белков, участвующих в эксцизионной репарации неспаренных оснований, MMR), р21, GADD45, циклина D, ДНК-цитозин-5-метил-трансферазы (MCMT), эндонуклеазы XPG. Для р21 опубликовано очень подробное описание его взаимодействия с PCNA, включающее вовлечение в этот процесс вторичной структуры белков.
На той же модели было показано, что эффективность репарации резко падает при использования в экспериментальной системе in vitro мутантных форм FEN1 и лигазы I, у которых не нарушена ферментативная активность, а только поврежден сайт их связывания с PCNA.
Рисунок 7. Белки, имеющие сайт QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y) для связывания с PCNA
Остается неясным, как все эти молекулы с PCNA-связывающим мотивом умудряются связаться с PCNA одновременно – ведь PCNA является гомотримером и может быть одновременно связан по данному мотиву не более, чем с тремя белками, а таких белков описано уже как минимум 15. Можно предположить, что в системе BER PCNA преимущественно связан с ДНК-полимеразой-δ(ε), FEN1 и лигазой I. Связывание же со всеми остальными белками, вероятнее всего, зависит от места и времени протекания реакции, в которую вовлечен PCNА и данные белки.