7.4. Постановка и учет реакций розеткообразования

Реакцию розеткообразования проводят в пробирках Флоринско-го, смешивая равные объемы, по 0,2-0,25 мл приготовленных суспен­зий лимфоцитов крови исследуемых животных с рабочими взвесями соответствующих для каждой реакции эритроцитарных маркеров. При этом в смеси должно содержаться 0,5-0,75 тыс. лимфоцитов, со­отношение которых с эритроцитарными маркерами должно быть в пределах 1:40-1:50. Создают условия для их взаимодействия, после которого клетки и образовавшиеся между ними комплексы фиксиру­ют и используют для изготовления постоянных препаратов, необхо­димых для учета результатов реакций.

Спонтанное розеткообразование.

0,25 мл лимфоцитов + 0,25 мл 0,8%-ной взвеси эритроцитов барана.

Центрифугируют 3 минуты при 180 g, инкубируют 30 минут при 30°С, инкубация 18 часов при 4-10°С.

В дальнейшем их фиксируют 0,5%-ным раствором глутарового альдегида 0,5 мл 20 минут при комнатной температуре. Прекращают фиксацию 4-5-кратными объемами дистиллированной воды.

Центрифугируют 10 минут при 180 g.

Реакции комплементарного, непрямого глобулинового и туберку­линового розеткообразования.

0,25 мл лимфоцитов + 0,25 мл 1%-ной взвеси эритроцитов быка.

Центрифугируют 3 минуты при 180 g, инкубируют 10 минут при 10°С.

После вышеприведенной фиксации выдерживают в течение 18-20 часов фиксированные лимфоциты глутаровым альдегидом клетки или центрифугируют 10 минут при 180 g.

Надосадок убирают, оставляя 0,2 мл, тщательно ресуспендируют, делают мазок типа «высушенной капли», высушивают, фиксируют в этиловом спирте 20 минут, окрашивают по Романовскому.

Подсчет ведут на 200 лимфоцитов, просматривая препараты под водной иммерсией с помощью светового микроскопа. Результат дает­ся а процентах. За розетку принимается лимфоцит, присоединивший не менее 3 эритроцитов. После соотнесения полученных данных с ре­зультатами гематологических исследований высчитывают содержа­ние розеткообразующих клеток в крови исследуемых животных в аб­солютных значениях.

Абсолютную численность клеток популяций розеткообразующих лимфоцитов крови исследуемых животных вычисляют по формуле

Ч = А ВС- 10"4,

где Ч - абсолютная численность клеток популяций розеткообразую­щих лимфоцитов в 1 мкл крови исследуемых животных; А - абсолютная численность лейкоцитов в 1 мкл крови; В - относительное количество лимфоцитов крови; С - относительное количество клеток популяций розеткообразующих лимфоцитов крови.

Тема 8. Клеточные методы диагностики инфекционных болезней

Клеточные методы диагностики инфекционных болезней. Тесты Т-системы лимфоцитов. При культивировании лейкоцитов in vitro при определенных условиях нормальные лимфоциты перифери­ческой крови могут превращаться в недифференцированные заро­дышевые клетки типа бластов. Процесс превращения лимфоцитов на искусственной питательной среде в различные промежуточные формы получил название р е а к ц и и

б л а с т т р а н с ф о р м а ц и и (РБТЛ). Морфологическая трансформация лимфоци­тов может быть индуцирована специфическим и неспецифичес­ким стимуляторами.

Неспецифический стимулятор представляет собой фитогемаг-глютинин (ФГА). Под его воздействием, обычно через 72 ч, на­блюдается отчетливая трансформация лимфоцитов в большие морфологические примитивные клетки, часть которых находится в состоянии митоза; используются для оценки функции лимфо­цитов и т.д.

Оценку трансформации и пролиферации лимфоцитов под вли­янием специфических антигенов применяют в основном для диаг­ностики аллергии.

П о к а з а т е л ь п о в р е ж д а е м о с т и н е й т р о ф и л о в (ППН). В сенсибилизированном организме элементы белой кро­ви, в том числе нейтрофилы, проявляют повышенную чувстви­тельность к аллергену. Учитываемый критерий повреждения ней­трофилов — усиление амебоидной реакции этих лейкоцитов при инкубации крови в смеси со специфическим аллергеном. Для по­вышения точности наблюдения за поврежденными нейтрофилами используют чисто химический метод окраски клеток на гликоген по А. Л. Шабадашу, который позволяет точнее отдифференциро­вать нейтрофильные лейкоциты от других форменных элементов крови (эозинофилы, лимфоциты и моноциты содержат значитель­но меньше гликогена, а в эритроцитах он отсутствует) и обнару­жить даже минимальные повреждения нейтрофилов (в виде аме­боидных реакций).

Количество обнаруживаемых поврежденных нейтрофилов, на­пример в присутствии туберкулина у больных туберкулезом, нахо­дится в прямой зависимости от степени активности специфичес­кого процесса (процент поврежденных нейтрофилов в активной фазе туберкулеза в 1,5—3,5 раза выше, чем при затихании про­цесса). Сегментоядерные нейтрофилы претерпевают аллергичес­кую перестройку значительно раньше, чем наружные кожные покровы.

Р е а к ц и я с п е ц и ф и ч е с к о г о л е й к о л и з а. Осно­вана на повреждении — разрушении лейкоцитов под влиянием ал­лергена; первично повреждаются лимфоциты, а остальные лейко­циты — вторично.

Механизм специфического лейколиза заключается в воздей­ствии аллергена на лимфоциты сенсибилизированного организма. Реакция служит для диагностики аллергических состояний у жи­вотных.

Р е а к ц и я и н г и б и ц и и м и г р а ц и и л е й к о ц и т о в. Основана на подавлении миграции макрофагов и лейкоци­тов под действием медиаторов, вырабатывающихся сенсибилизи­рующимися лимфоцитами в присутствии специфического антиге­на.

С п е ц и ф и ч е с к о е р о з е т к о о б р а з о в а н и е. Осно­вано на следующем феномене: В-лимфоциты животного, имму­низированного гетерогенными эритроцитами, способны in vitro фиксировать на своей поверхности соответствующие эритроциты, образуя «розетки». Реакция получила название «иммуноцитоприлипание». Воспроизводится in vitro, если сенсибилизированные лимфоциты смешивают со взвесью танизированных эритроцитов, на которых фиксируются соответствующие аллергены.

Ф а г о ц и т а р н а я а к т и в н о с т ь л е й к о ц и т о в. Ведущую роль в фагоцитозе играют нейтрофильные гранулоциты и макрофаги. Активность нейтрофильных гранулоцитов можно установить несколькими методами, принимая во внимание следу­ющее: способность к адгезии — определение количества клеток, фиксирующихся на стеклянной пластинке при 37 °С; мигра­цию — выход нейтрофильных гранулоцитов из капилляров в окру­жающую ткань (метод «кожного окна»); хемотоксис — способ­ность клеток перемещаться в направлении химического градиента; фагоцитарную активность — способность захватывать и унич­тожать бактерии. Этот тест наиболее полно характеризует функ­циональные способности нейтрофильных гранулоцитов и широко применяется для оценки уровня клеточной неспецифической резистентности.

При постановке фагоцитарной реакции учитывают три показа­теля: активность фагоцитоза (фагоцитарный показатель, процент фагоцитоза) — процент фагоцитарных бактерий; интенсивность фагоцитоза (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число) — сред­нее число микробов, поглощенных одним нейтрофильным гранулоцитом; завершенность фагоцитоза (индекс переваривания) — отношение числа погибших микробных клеток к живым в мазке или снижение интенсивности роста микробов после контакта их с кровью.

Р е а к ц и я б е с с у б с т р а т н о го в о с с т а н о в л е н и я

н и т р о с и н е г о т е т р а з о л и я (НСТ-тест). Осно­вана на уникальной способности фагоцитов утилизировать кисло­род с образованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ-тест принадлежит к чувствительным индикаторам нормы и патологии. НСТ-тест предложен для разграничения острых бакте­риальных и вирусных инфекций.

Контрольные вопросы. 1. Какие клетки принимают участие в развитии иммун­ного ответа? 2. Как осуществляется регуляция иммунного ответа? 3. Как осуще­ствляется генетический контроль иммунного ответа? 4. Какие клетки участвуют в реакциях клеточного иммунитета? 5. Какие вы знаете медиаторы клеточного им­мунитета?