Тема 7. Феномен розеткообразования в иммунологии

Метод розеткообразования одним из первых получил распро­странение в иммунологии, однако и сегодня он не потерял своей зна­чимости для количественной оценки субпопуляций лимфоцитов. Не­сомненно, метод розеткообразования по своей точности уступает многим модификациям методов на основе моноклональных антител, но для основных целей практической иммунологии точность резуль­татов количественной оценки субпопуляций лимфоцитов, получае­мых с его помощью, достаточна. Простота постановки теста и низкая стоимость реактивов делают данный метод достаточно привлекатель­ным для большого числа научно-исследовательских лабораторий.

Методы розеткообразования основаны на взаимодействии мем­бранных рецепторов лимфоцитов с эритроцитами, что визуально оп­ределяется при микроскопировании в виде розеток - образований, со­стоящих из лимфоцитов, к поверхности которых присоединены эрит­роциты.

На поверхности лимфоцитов имеется целый ряд структур (марке­ров), позволяющих идентифицировать Т-лимфоциты (тимусзависи-мые) и В-лимфоциты (тимуснезависимые).

Применение эритроцитарных маркеров позволяет с помощью различных вариантов реакции розеткообразования, проводимых од­новременно, определять численность и соотношение функционально активных, свободных клеток иммунной системы организма и судить об его иммунокомпетентности. Т-лимфоциты определяют с помощью реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана или коз; В-лимфоциты — с помощью реакции комплементарного розетко­образования с эритроцитами быка, образовавшими иммунные ком­плексы с гетерофильными антителами и комплементом; большую часть лимфоцитов-киллеров - с помощью реакции непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка, образовавшими иммунные комплексы лишь с гетерофильными антителами. Антиген-реактивные лимфоциты определяют с помощью реакции антигенсвязывающего розеткообразования с эритроцитами быка, адсорбиро­вавшими антигены возбудителя заболевания (ППД-туберкулин, антиген-бруцелл).

7.1. Проведение исследований

Для качественного проведения всего комплекса исследований необходимо иметь по 1,5-2,0 мл крови исследуемых животных, хра­нящейся не более суток при температуре 4-10°С и стабилизированной антикоагулянтом. Для стабилизации крови крупного рогато­го скота лучше использовать приготовленный на физиологическом растворе 2,7%-ный раствор трилона Б рН 7,0-7,4 в соотношении 0,1 на 1,0 мл крови.

Для определения численности популяций лимфоцитов крови ис­следуемых животных необходимо проводить гематологические ис­следования. Абсолютное количество лейкоцитов крови удобнее опре­делять в жидкости Тюрка (к 100 мл 3%-ного раствора ледяной уксус­ной кислоты добавляют 1 мл 1%-ного раствора метиленовой сини) при помощи камеры Горяева, а относительное - с помощью светового микроскопа в мазках крови, окрашенных по Романовскому.

7.2. Выделение лимфоцитов на градиенте плотности

Для выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота используется ряд методов, позволяющих получить относительно чис­тую суспензию лимфоцитов. Наибольшее количество этих клеток вы­деляется при центрифугировании в градиенте плотности урографина или смеси фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3.

Из 76%- или 60%-ного урографина с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см3. В теплой дистиллированной воде готовят 9%-ный раствор фиколла-400 и 34%-ный раствор урографина. Затем смешивают их в соотношении 12:5 соответственно и доводят плотность до 1,077 г/см3.

В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 2 мл 17%-ного раствора урографина или смесь фиколлурографина, на который наслаивают по 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g, если кровь от взрослых животных, или при 600 g, если кровь от молодых животных. После центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовав­шийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой и от­мывают от примесей центрифугированием в пробирках Флоринского по 5 минут при 210 g, используя дважды по 3 мл раствора Версейа, а затем такое же количество раствора Хенкса, в 1 мл которого готовят взвеси выделенных клеток с концентрацией 2-3 тыс./мкл лимфоцитов для последующих постановок реакций розеткообразования. Для под­счета разведения лимфоцитов в 0,38 мл 3%-ной уксусной кислоты вносится 0,02 мл взвеси лимфоцитов. Подсчитывают в камере Горяева в 5 больших квадратах, разделенных на 4, по диагонали. Получен­ную сумму делим на 8. Результат равен количеству мл раствора Хенкса, необходимого для разведения осадка лимфоцитов, чтобы полу­чить концентрацию 2-3 тыс/мкл. Данный коэффициент выведен из расчета, что при концентрации 2-3 тыс/мкл в среднем должно со­держаться 8 клеток в одном большом квадрате.