Индикация вируса

Экспресс-методы выявления антигена вируса НБ. Через 24 ч в инфицированных культурах клеток (шт Н) наблюдают появление многоядерных симпластов и цитоплазмати-ческих эозинофильных включений неправильной глыбчатой формы Через 48 ч после заражения цитоплазма бывает нафарширована тельцами-включениями В ядрах изменений не отмечалось Разработан высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют монАТ к вирусу НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и короткими сроками (3-4 ч) получения результатов. Непрямой точечный вариант ИФА является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с различных органов.

Для идентификации РНК вируса НБ пользуются экспресс-методом ПЦР, амплифици-рующей участок длиной 238 п.н. в гене белка слияния F с использованием в качестве праймеров нуклеотидов, фланкирующих последовательность.

В организме птицы, зараженной вирусом НБ, в процессе продолжительного контакта с вирусом эритроциты теряют способность ГА (становятся инаглютинабельными). Чтобы кос­венно доказать присутствие вируса в организме, от исследуемой птицы берут 0,04 мл крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость, вирус дол­жен обладать высокой агглютинирующей активностью. Если на стекле наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой капле крови вируса НБ. Учет ре­акции ведут через несколько секунд. Метод применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так как вакцинные штаммы лентогенной группы инагглютинабельности эритроцитов не вызывают.

РГА. Используют с целью ориентировочного определения присутствия вируса в иссле­дуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и амниотической жидко­стях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и селезенке погибшей птицы, в жид­кой и клеточной фракциях тканевых культур. Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека -и др. Разные виды вирусов и даже шт. одного и того же вируса могут отличаться друг от друга способностью агглютинировать эритроциты указанных жи­вотных. Спектр ГА служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Например, большинство шт. вируса НБ не вызывает ГА эритроцитов лошади, чем отличает­ся от вируса классической чумы птиц, который способен ГА их в высоких разведениях. Предложена экспресс-диагностика атипичных форм НБ кровекапельной реакцией гемагглютинации (ККРА). Простота постановки её, совмещение исследований на НБ и пуллороз-тиф позволяют включить ее в технологический процесс ветобработки птицы.

Серологическая идентификация.

РТГА. Основной, высокоспецифичный и простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо иметь эталонные специфические сыворотки к виру­су и выделенный на КЭ вирус (аллантоисная жидкость) РТГА ставят общепринятым мето­дом в макро- и микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эта­лонная специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого или 1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ. Для быстрой идентификации выделенного вируса рекомендуют следующий метод: на предметное стекло наносят капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем ставят пробу на нейтрализацию ГА-активности. Для этого на предмет­ное стекло наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит вы­деленный вирус является вирусом НБ.

Приготовление гипериммунных сывороток. 5-8-мес кур с титрами анти-ГА поствакци­нального иммунитета против НБ 1:4-1:64 гипериммунизируют вирус-вакцинами из шт. В1, La Sola, Н. Первое введение делают с адъювантом (автоклавированная смесь ланолина с вазелином в соотношении 1:1,5). На 1 мл смеси добавляют 5 мл вакцинного вируса. Смесь растирают в ступке и помещают в водяную баню на 30 мин при температуре 56°С.

1-й раз вакцину вводят с адъювантом в объеме 1 мл внутримышечно, 2-й раз - через 3 дня без адъюванта, 3-й раз еще через 3 дня без адъюванта. Через 10 дн проверяют актив­ность гипериммунных сывороток Титр их обычно составляет 1:6144-1 12288.

РН на КЭ. Используют для идентификации вируса редко, так как она трудоемка и дли­тельна. Реакцию используют в спорных ситуациях РН ставят общепринятым методом обычно в варианте разведения вируса и постоянной дозы сыворотки. Реакцию считают по­ложительной при индексе нейтрализации >21g.

РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена РСК как бы­стрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности

РИФ. Метод основан на применении родаминсульфохлорида для конъюгации иммун­ной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках пав­ших и убитых птиц Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны Для обнаружения специфического АГ применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В кон­трольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного све­чения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов. Установлено, что вирусный АГ в зараженных культурах клеток (ФЭК и ВНК-21) выяв­ляется, начиная с 4 ч (для велогенных штаммов) и с 6 ч (для лентогенных штаммов), до 10-12ч свечение АГ отмечали только в цитоплазме, а через 20 ч - в цитоплазме и ядрах клеток.

РИГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных высо­кочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с AT к вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей .

ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения до появ­ления ЦП Д. Через 12 ч после заражения видны единичные АГ-содержащие клетки.

Идентификация при помощи монАТ. Исследованы различные штаммы вируса и изс-ляты НБ на гомологичное родство к монАТ. В результате тестирования 40 изолятов и штаммов с использованием набора из 9 монАТ выявлено 8 групп. Вирусы каждой группы обладали не только общими АГ-свойствами, но и одинаковыми эпизоотическими чертами МонАТ к ГА и гликопротеину F рекомендовано использовать для определения патогенности и биологической характеристики штаммов, циркулирующих в стадах вакцинированных и невакцинированных птиц Они могут быть использованы для идентификации полевых изо­лятов, АГ-родственных шт. La Sota и В1, быстрой дифференциации этих вакцинных штам­мов от вирулентных полевых изолятов.

Метод картирования олигонуклеотидов. Этим методом исследован биохимический состав нескольких штаммов вируса НБ, выделенных в штатах Калифорния, Техас и Флори­да, это позволило легко дифференцировать штаммы друг от друга. Часть штаммов оказа­лись идентичными. Считают, что метод олигонуклеотидного картирования может быть эф­фективно использован с целью оценки эпизоотической ситуации.

Определение вирулентности выделенного вируса. Помимо серологической иденти­фикации часто возникает необходимость определения вирулентности выделенного изолята. Это важно, когда возникает подозрение, что выделенный возбудитель является штаммом, применяемым для массовой вакцинации. Степень вирулентности можно определить следующими методами.

Метод Хенсона - определение индекса внутримозговой вирулентности. Исследуемым материалом в разведении 1:10 заражают интрацеребрально в дозе по 0,05 мл 10 1-дн цып­лят, полученных от невакцинированных против НБ кур. Время наблюдения 8 дн. Все по­гибшие цыплята считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 2. Все цыплята, проявившие клинические признаки, тоже считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 1. Индекс интрацеребральной патогенности вычисляют путем деления суммы балов на 80 (число наблюдений за 10 цыплятами в течение 8 дн). Для ленто-генных штаммов индекс до 0,2, для велогенных штаммов - больше 1,5. Недостатком данной методики является - постоянный период наблюдения - 8 дн.

Метод определения среднего времени гибели 10-дн эмбрионов, вызванный минималь­ный летальной дозой (СВГ/МЛД). Для этого готовят серию 10-кратных разведении иссле­дуемого вируса от 10 ^-1 до 10^-10, пять из них (10 ^-1, 10 ^-7, 10 ⁸, 10 ⁹, 10 ^-10 используют для зара­жения 10-дн КЭ в аллантоисную полость в объёме по 0,1 мл. Каждым из этих разведении инокулируют по 10 КЭ: по 5 заражают в 8 ч утра и -в 16 ч (в общем заражают 50 эмбрио­нов) и инкубируют их при 37°С. Наблюдают за ними 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Час гибели каждого погибшего эмбриона регистрируют. Минимальной летальной дозой считают самое большое разведение вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эм­брионов. Среднее время гибели находят путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой, на число эмбрионов: среднее время гибели до 60 ч - велогенные штаммы; среднее время гибели от 61 до 90 ч - мезогенные штаммы; среднее время гибели от 90 и больше 100 ч - лентогенные штаммы. Однако методы эти дорогостоящие и требуют много времени - необходимо затратить по меньшей мере 7 дн для того, чтобы дифференцировать дикие штаммы от вакцинных.

РСК. Быстрый и дешевый способ дифференциации штаммов. Диагноз ставят в течение 3 дн после получения проб. Самое слабое связывание комплемента вызывают велогенные дикие штаммы, самое сильное -лентогенные (например La Sota), в границах между сильны­ми и слабыми - мезогенные. Кроме того, вирулентные штаммы менее антигенны, чем вак­цинные, в отношении индукции синтеза КСА у морских свинок. Самую отчетливую диффе­ренциацию дает сыворотка морских свинок, иммунизированных штаммом Хитчнера.

Биопроба. Начиная с 1972 г. в США, а затем и в других странах были выделены штаммы с очень высокой вирулентностью. Их называют штаммами WND (висцеро-тропные штаммы НБ). Для идентификации проводится биопроба на восприимчивых цыпля­тах в возрасте не менее 6 нед. Цыплят заражают в клоаку. Несколько особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают 10 дн. Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дн, производят вскрытие В США принята следующая оценка интенсивности изменений (в баллах): точные кровоизлияния или некротические из­менения в трахее - 25; точечные кровоизлияния или некротические изменения в трахее и сопутствующая им отечность трахеи и в области входа в грудную клетку - 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе - 100; некроз и изъязвление желез сле­пой кишки и пейеровых бляшек - 100; точечные кровоизлияния или некротические измене­ния слизистой оболочки клоаки - 10; воспаление брюшины в области яичника - 10; точечные кровоизлияния в других местах - 10. Диагностика VVND считается обоснованной, если об­щее число баллов достигает 150 или более.