1.3.2.Методика проведения эксперимента

Эксперимент был проведен согласно методике предложенной в статье «Plant growth-promoting bacteria confer resistance in tomato plants to salt stress» Shimon Mayak, Tsipora Tirosh and Bernard R. Glick [30].

2. Результаты и обсуждение

2.1 Изучение локализации бактерий p.Putida

Бактерии Pseudomonas putida являются ризосферными микроорганизмами. Эти бактерии характеризуются выраженной ростостимулирующей активностью. Одним из возможных способов, с помощью которого осуществляется стимуляция роста растений, может быть снижение уровня растительного гормона этилена за счет синтеза бактериями фермента АЦК-дезаминазы.

Ранее нами было показано, что из коллекции бактерий P.putida наибольшей ростостимулирущей аткивностью обладает P.putida B37. В связи с этим дальнейшее исследование было направлено на исследование данного штамма.

На первом этапе было показано, что бактерии P. putida В37 являются ризосферными. Для этого недельную рассаду томатов обработали культурой бактерий P.putida B37. Спустя 3 недели было проведено микроскопическое исследование корней томатов. Результаты представлены на рисунке 1.

Клетки бактерий P.putida B37

Рисунок 1 а,б. Бактерии P.putida B37 на корнях томата

Таким образом, было установлено, что клетки бактерий P.putida B37 локализованы на корнях растений, преимущественно в зоне корневого чехлика.

2.2 Трансформация клеток Pseudomonas putida в37

На следующем этапе была проведена трансформация бактерий P.putida B37 плазмидой pACD, содержащей acdS ген бактерий P.mendocina 9-40.

Отбор трансформантов осуществляли на селективной среде, содержащей антибиотик стрептомицин в концентрации 50 мкг/мл.

Рисунок 2. Рестрикционная карта плазмиды pACD

В результате эксперимента было отобрано 16 клонов; все были проверены на наличие плазмиды pACD. Для этого из клеток бактерий была выделена плазмидная ДНК. Все отобранные клоны содержали плазмиду размером 12900 п.н., что соответствует плазмиде pAYS31, несущей ген acdS.

Полученные клоны использовались для определения активности АЦК-дезаминазы.

2.3. Исследование способности бактерии Pseudomonas putida b37 (pAcd) стимулировать рост сельскохозяйственных растений томатов в условиях загрязнения грунта тяжёлыми металлами

Семена томатов были посеяны во влажный грунт. После 1 недели роста рассада одинакового размера была отобрана и пересажена в отдельные пластмассовые стаканчики объемом 150 мл. Спустя три дня рассада была разделена на 3 части. Одна часть была обработана 40 мл бактериальной суспензии P. putida B37 (рАСD), другая часть - 40 мл бактериальной суспензии P. putida B37, третья часть – 40 мл деионизированной воды. Затем 1 часть рассады обрабатывалась раствором Zn (0,24 г/кг), другая – Cd (0,02 г/кг), третья- Sn (0,25 г/кг). Результаты учитывали по истечении 5 недель.

Как показывают результаты экспериментов, представленные в таблице 1, а также на рисунках 3,4,5 используемые концентрации Zn (0,24 г/кг), Cd (0,02 г/кг), Sn (0,25 г/кг) приводили к подавлению роста растений томатов, уменьшению длины стебля и корней, а также их биомассы. Вместе с тем, при внесении в почву суспензии бактерий P. putida B-37 (pACD), степень подавления роста томатов была ниже, растения имели большую массу, чем контрольные.

В случае внесения в почву цинка у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37 (pACD), обнаруживалось в 1,19 раза большая длина стебля, в 1,43 большая длина корня и в 1,25 раза большая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

В случае внесения в почву цинка у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37, обнаруживалось в 1,08 раза большая длина стебля, в 1,43 большая длина корня и в 1,0185 раза меньшая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

В случае внесения в почву кадмия у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37 (pACD), обнаруживалось в 2,65 раза большая длина стебля, в 1,65 раза большая длина корней и в 3,19 раза большая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

В случае внесения в почву кадмия у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37, обнаруживалось в 1,3 раза большая длина стебля, в 1,098 раза большая длина корней и в 1,095 раза большая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

В случае внесения в почву олова у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37 (pACD), обнаруживалось в 1,25 раза большая длина стебля, в 1,3 раза большая длина корней и в 1,6 раза большая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

В случае внесения в почву олова у растений томатов, обработанных бактериальной суспензией P.putida B37, обнаруживалось в 1,022 раза большая длина стебля, в 1,077 раза меньшая длина корней и в 1,17 раза большая биомасса по сравнению с контрольными растениями.

Таблица 1. Влияние АЦК-дезаминазы на рост и развитие растений томатов, выросших в грунте, загрязненном тяжёлыми металлами

Параметр	Загрязнение почвы Zn (0,24 г/кг)			Загрязнение почвы Cd (0,02 г/кг)			Загрязнение почвы Sn (0,25 г/кг)
	Вода	P.putida B37	P.putida B37 (pACD)	Вода	P.putida B37	P.putida B37 (pACD)		Вода	P.putida B37	P.putida B37 (pACD)
Длина стебля, см	35,4±0,42	38,2±0,45	42,1±0,64	14,1±0,39	18,3±0,44	37,4±0,57		31,7±0,49	32,4±0,48	39,7±0,61
Длина корня, см	25,3±0,33	36,1±0,44	36,2±0,43	23,3±0,31	25,6±0,34	38,5±0,42		32,1±0,43	29,8±0,35	41,9±0,48
Биомасса, г	5,5±0,02	5,4±0,02	6,9±0,08	2,1±0,03	2,3±0,03	6,7±0,09		4,2±0,03	4,9±0,04	6,8±0,06

Наибольшие различия наблюдаются в биомассе растений томатов. Это свидетельствует о том, что у растений, обработанных суспензией P.putida B37 (pACD), наблюдается не только большая длина стебля и корня, но и лучшее развитие по сравнению с контрольными растениями, данные представлены на рисунках 3,4,5.

Рисунок 3. Томаты, выращенные в грунте с внесением цинка (0,24 г/кг)

1 2 3

Рисунок 4. Томаты, выращенные в грунте с внесением кадмия (0,02 г/кг)

1 2 3

Рисунок 5. Томаты, выращенные в грунте с внесением олова (0,25 г/кг)

1 2 3

Обозначения на рисунке: 1. Растения, обработанные суспензией бактерий P.putida B37 (pACD); 2. растения, обработанные суспензией бактерий P.putida B37; 3. Растения, обработанные дистиллированной водой.

Полученные результаты показывают, что при выращивании растений на загрязнённой тяжёлыми металлами почве, обработанной суспензией бактерий и P.putida B37 (pACD), степень подавления их роста была гораздо меньше по сравнению с растениями, обработанными суспензией бактерий P.putida B37 или обработанными дистиллированной водой. Это говорит о том, что данные бактерии могут уменьшить некоторые негативные эффекты стресса, вызванного токсичностью тяжёлых металлов.

Выводы

1. Была установлена локализация бактерий P.putida на корнях растений в зоне корневого чехлика

2. Была проведена трансформирмация плазмидой, несущей acdS ген, клеток Pseudomona putida B37 с последующим отбором трансформантов.

3. Бактерии P.putida B37 (рАСD) способны эффективно повышать устойчивость растений томатов стрессу. Вызванному тяжелыми металлами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002.

2. Bayliss C., Bent E., Culham D. E., MacLellan S., Clarke A. J., Brown G. L. et. al. Bacterial genetic loci implicated in Pseudomonas putida GR 12-2R3- canola mutualism: identification of an exudate-inducible sugar transporter // Can. J. Microbiol. – 1997. – V.43. – p.809-818.

3. Bell C. R., Dickie G. A., Harvey W. L. G., Chan. J. W. Y. F. Endophytic bacteria in grapevine // Can. J. Microbiol. – 1995. – V.41. – p.46-53.

4. Bloemberg G. V., Lugtenberg B. J. J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria // Curr. Opin. Plant Biol. – 2001. – V.4. – p.343-350.

5. Brown M. E. Seed and root bacterization // Ann. Rev. Phytopathol. – 1974. – V.12. – p.181-197.

6. Dobbelaere S., Vanderleyden J., Okon Y. Plant growth-promoting effects of diazotrophs in the rhizosphere // Crit. Rev. Plant Sci. – 2003. – V.22. – p.107-149.

7. Glick B. R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria // Can. J. Microbiol. – 1995. – V.41. – p.109-117.

8. Gray, E. J., D. L. Smith D. L. Intracellular and extracellular PGPR: commonalities and distinctions in the plant-bacterium signaling processes // Soil Biol. Biochem. – 2005. – V.37. – p.395-412.

9. Hallman, J., Quadt-Hallman A., Mahafee W. F., J. W. Kloepper J. W. Bacterial endophytes in agricultural crops // Can. J. Microbiol. – 1997. – V.43. – p.895-914.