1.3. Методы

1.3.1. Клонирование гена acdS

1. морозить. Повторить 2-3 раза. С помощью иголки сделать в дне ПЦР-пробирки с гелем небольшое отверстие.

2. Вставить ПЦР-пробирку с гелем в эппендорф. Центрифугировать при комнатной температуре, 2000g в течение 1 минуты.

3. ТАЕ-буфер во внешнем эппендорфе содержит ДНК.

V. Выделение плазмидной ДНК.

Реактивы:

1. буфер 1: 25мМ Tris-HCl, рН=8,0; 10мМ ЭДТА;

2. буфер 2: 0,2 н. NaOH; 1% SDS; используется свежеприготовленным;

3. буфер 3: 3М CH₃COOK, рН=4,8.

4. изопропанол;

5. ТЕ-буфер;

6. 10M LiCl;

7. 96% этанол;

8. фенол;

9. смесь хлороформ-изопропанол, 23:1.

Ход работы:

1. бактерии выращивали в 20 мл питательного бульона, содержащего антибиотик, в течение 24 часов;

2. осаждали центрифугированием при 13000g в течение 2 минут;

3. осадок ресуспендировали в 200 мкл буфера 1, содержащего лизоцим (4 мг/мл, добавляли непосредственно перед использованием), выдерживали в течение 30 минут при температуре 37ºС;

4. добавляли 800 мкл буфера 2, перемешивали (без встряхивания), выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут;

5. добавляли 500 мкл буфера 3, перемешивали, выдерживали на ледяной бане в течение 10 минут;

6. осаждали центрифугированием при 13000g, 4ºС в течение 10 минут;

7. супернатант переносили в новый эппендорф;

8. добавляли 0,6 объема изопропанола, выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут;

9. осаждали центрифугированием при 13000g, 4ºC в течение 10 минут;

10. удаляли супернатант, осадок подсушивали, перевернув эппендорф и поместив его на фильтр;

11. осадок ресуспендировали в 200 мкл ТЕ-буфера, добавляли 200 мкл 10M LiCl, выдерживали при температуре -20ºС в течение 30 минут;

12. осаждали центрифугированием при 13000g, 4ºС в течение 30 минут;

13. супернатант переносили в новый эппендорф;

14. добавляли равный объем 96% этанола, выдерживали при температуре -20ºС в течение 30 минут;

15. осаждали центрифугированием при 13000g, 4ºC в течение 20 минут;

16. удаляли супернатант, осадок подсушивали, перевернув эппендорф и поместив его на фильтр;

17. осадок ресуспендировали в 500 мкл ТЕ-буфера, добавляли 500 мкл фенола, встряхивали;

18. осаждали центрифугированием при 13000g, комнатная температура в течение 3 минут;

19. супернатант переносили в новый эппендорф;

20. добавляли 250 мкл фенола, 250 мкл смеси хлороформ-изопропанол, встряхивали;

21. осаждали центрифугированием при 13000g, комнатная температура в течение 3 минут;

22. супернатант переносили в новый эппендорф;

23. добавляли 500 мкл смеси хлороформ-изопропанол, встряхивали;

24. осаждали центрифугированием при 13000g, комнатная температура в течение 2 минут;

25. повторяли пункты 22-24;

26. супернатант переносили в новый эппендорф;

27. добавляли 0,2 объема 10М LiCl, 0,8 объема изопропанола, выдерживали при температуре -20ºC в течение 20 минут;

28. осаждали центрифугированием при 13000g, 4ºC в течение 20 минут;

29. удаляли супернатант, осадок подсушивали, перевернув эппендорф и поместив его на фильтр;

30. осадок ресуспендировали в 20 мкл ТЕ-буфера; наличие плазмидной ДНК определяли с помощью электрофореза в агарозном геле.

VI. Лигирование.

Лигирующая смесь:

ДНК (ген acdS) – 5 мкл;

Векторная ДНК – 2 мкл;

буфер для лигазы – 1 мкл;

лигаза – 0,5 мкл;

деионизированная вода – 1,5 мкл.

Лигирующую смесь выдерживали при температуре 16ºС в течение 4 часов.

IX. Трансформация клеток Escherichia coli DH5α.

Реактивы:

1. 0,1М CaCl₂;

Ход работы:

1. клетки Escherichia coli DH5α выращивали в 10 мл бульона LB до достижения log-фазы роста;

2. в эппендорфы вносили 1,5 мл культуры и выдерживали на ледяной бане в течение 10 минут;

3. осаждали центрифугированием при 5000g, 4ºС в течение 2 минут;

4. удаляли надосадок, осадок ресуспендировали в 1 мл 0,1М CaCl₂, выдерживали на ледяной бане в течение 15 минут;

5. осаждали центрифугированием при 6000g, 4ºС в течение 2 минут;

6. удаляли надосадок, осадок ресуспендировали в 80 мкл 0,1М CaCl₂, добавляли 10 мкл раствора плазмидной ДНК, выдерживали на ледяной бане в течение 30 минут;

7. клетки подвергали тепловому шоку, для чего выдерживали на водяной бане при температуре 42ºС в течение 2 минут;

8. добавляли 1 мл бульона LB, выдерживали при температуре 37ºС в течение 1 часа;

9. клетки высевали на селективную среду (содержащую антибиотик ампициллин, 100 мкг/мл) и инкубировали в термостате 24 часа.

10. При трансформации клеток Pseudomonas mendocina в методику были внесены следующие изменения: клетки Pseudomonas mendocina выращивали в 10 мл бульона LB до достижения стационарной фазы роста; после теплового шока пробирки выдерживали при температуре 37ºС в течение 3 часов.