1. Материалы и методы

1.1. Объект исследований

В качестве объекта исследований использовали штамм бактерий Escherichia coli DH5α и Escherichia coli Xl-1blue, полученный из коллекции НИЛ молекулярной генетики биологического факультета БГУ.

1.2. Среды и реактивы

В работе использовались:

Полноценный питательный агар

Питательный агар (порошок)

(НИИ по производству питательных сред

г. Махачкала) 13 г

Агар-агар 6 г

Дистиллированная вода до 300 мл

Стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм. 30 минут.

Рыбный бульон

Питательный бульон для

культивирования микроорганизмов 15 г

NaCl 4 г

Дистиллированная вода до 1 л

рН доводили с помощью NaOH до 7,5.

Стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм. 30 минут.

LB-бульон

Бакто-триптон 10 г

Бакто-дрожжевой экстракт 15 г

NaCl 10 г

Дистиллированная вода до 1 л

рН доводили с помощью NaOH до 7,5.

Стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм. 30 минут.

TE-буфер

10мМ Tris-HCl, рН=7,4

1мМ ЭДТА, рН=8

ТАЕ-буфер (×10)

Tris-OH 48,4 г

0,5М ЭДТА, рН=8 20 мл

CH₃COOH ледяная 11,42 мл

Дистиллированная вода до 1 л

0,1 М раствор CaCl₂

CaCl₂ 1,11 г

Дистиллированная вода до 100 мл

Агарозный гель для электрофореза

Агароза 1 г

ТАЕ-буфер (*1) до 100 мл

Этидиум бромид 20 мкл

Кипятили до полного растворения агарозы; этидиум бромид добавляли после растворения агарозы.

Среда № 1 для определения активности АЦК-дезаминазы

D-глюкоза 0,4г

пептон 0,1г

сухой дрожжевой экстракт 0,06г

дистиллированная вода до 20 мл

стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм 30 минут.

Среда № 2 для определения активности АЦК-дезаминазы

сахароза 1г

АЦК 0,1г

KH₂PO₄ 0,1г

K₂HPO₄ 0,1г

MgSO₄*7H₂O 0,05г

CaCl₂*2H₂O 0,013г

FeSO₄*7H₂O 0,0013г

дистиллированная вода до 100 мл

стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм 30 минут.

Примечание: АЦК добавляли в среду после ее автоклавирования, в стерильных условиях; для CaCl₂ и FeSO₄ растворы готовили отдельно.

0,01 М раствор СаСl₂

CaCl₂ 0,111г

дистиллированная вода до 100 мл

стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм. в течение 30 минут; в среду № 2 добавляли 0,88 мл раствора.

0,01 М раствор FeSO₄

FeSO₄ *7Н₂О 0,278 г

дистиллированная вода до 100 мл

стерилизовали кипячением в течение 30 минут; в среду № 2 добавляли 0,04 мл раствора.

Калий-фосфатный буфер 0,1 М (рН 7,5)

КН₂РО₄ 27,2 г

К₂НРО₄ 45,6 г

дистиллированная вода 400 мл

Примечание: каждую соль по отдельности растворяли в 100 мл воды, затем разводили в два раза, затем раствором KH₂PO₄ титровали раствор К₂НРО₄ до необходимого рН.

Трис(гидроксиметил)аминометановый буфер 0,1 М (рН 8,5)

трис(гидроксиметил)аминометан 0,726 г

дистиллированная вода до 60 мл

рН доводили с помощью концентрированной НСl.

Реактив Кумасси

Растворяли 100 мг кумасси бриллиантового голубого G-250 (фирма Sigma) в 50 мл 95% этанола. К раствору добавляли 100 мл 85% фосфорной кислоты и доводили дистиллированной водой. Фильтровали.