1. Какие основные вещества входят в состав питательных сред?

2. Этапы приготовления питательных сред?

3. Условия стерилизации питательных сред автоклавированием, кипячением?

4. Каким образом стерилизуют питательные среды, содержащие термолабильные соединения?

5. Основные условия хранения питательных сред?

Лабораторное занятие 5 – Техника выращивания изолированных тканей растений Задание 1 – Освоить технику выращивания изолированных тканей растений

Пояснение к заданию:

Культивирование растительных клеток вне организма осуществляется двумя способами:

1. На поверхности полутвердой агаровой питательной среды.

2. Погруженными в жидкую среду.

При первом способе эксплант помещается на поверхность среды так, чтобы контакт со средой был хорошим, но он не был полностью погружен в агар. Сегменты стебля, корнеплодов, клубней погружают в среду на 1/3 их длины, небольшие экспланты (диски и кубики тканей) приводят лишь в соприкосновение со средой.

Преимущества данного способа выращивания:

1. ткань, находясь в воздухе, хорошо аэрируется (снабжается кислородом воздуха), что очень важно для успешного роста культуры;

2. практически исключается явление витрификации (появление аномальных побегов)

Выращивание экспланта в жидкой среде возможно:

- в пробирке на фильтре, при этом, как и при первом способе ткань касается раствора с одной стороны (фильтра), что затрудняет вывод токсических веществ;

- с продуванием жидкой среды воздухом;

- в проточной культуре (Бутенко, 1964).

Преимущества второго способа выращивания:

1. ткань лучше снабжается питательными веществами;

2. епоявляется возможность вносить изменения в состав трофических элементов в процессе культивирования;

3. легче происходит удаление токсических веществ, образующихся в ходе роста ткани, в результате чего рост идет более интенсивно (Бутенко, 1964).

Выбор способа культивирования зависит от целей, условий, этапа размножения, типа используемых растительных структур и пр.

При каллюсном типе структур исходным растительным материалом является каллюс (рисунок 5.1, 5.2). Вначале на любом выбранном для культивирования органе делают надрез, на поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцируется и регенерирует.

При суспензионной культуре исходным растительным материалом служат изолированные клетки выбранного органа или измельченный каллюс. Клетки помещают в жидкую питательную среду (2-3 г свежей массы ткани на 60-100 мл среды) и культивируют при постоянном перемешивании в колбах на качалке или в специальных сосудах с помощью роллеров разного типа. За счет лучшего снабжения клеток питательными веществами происходит их интенсивное деление, новые клетки не отделяются, а их скопление увеличивается. Из полученных комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс, либо зародыш.

Рисунок 5.1 – Образование каллюса на черенке лещины разнолистной при культивировании в условиях гидропоники

Рисунок 5.1 – Образование корней из каллюса на черенках секуринеги полукустарниковой при культивировании в условиях гидропоники

Меристематические культуры используют в основном в садоводстве для получения безвирусных клонов. В качестве исходного растительного материала используется меристема (образовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и образованию новых клеток, отличающаяся высокой метаболической активностью). При культивировании изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки.

С помощью культуры протопластов возможно выращивание новых растений с заданными свойствами, скрещивание представителей разных видов и родов. Приготовленную из мезофила суспензию обрабатывают ферментами, разрушающими клеточные стенки, в результате чего начинается слияние, обмен органеллами разных клеток. После слияния ферменты удаляются, происходит регенерация клеточной стенки с последующим делением новых клеток.

Культуру пыльников используют для получения гаплоидных растений, которые после воздействия колхицина или слияния протопластов, образуют плодовитые гомозоготные чистые линии, имеющие большое значение для селекции, так как в последующих поколениях всегда обладают заданными признаками. Стерильные пыльники (чаще всего недозрелые) переносят на питательную среду, вызывая деление пыльцевых клеток с образованием каллюса или гаплоидного зародыша (Бутова, Табацкая, 1975; Бутенко, Гусев, Киркин, 1987 и др.).

Регенерация растений (восстановление целого организма из его части) может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, и косвенная – с промежуточной стадией каллюса. В случае косвенной регенерации возможен органогенез (образование из каллюса придаточных побегов и корней) и соматический эмбриогенез (с образованием из каллюса зародыша, а затем развитием целого растения).

Регенерация управляется определенными концентрациями и соотношениями фитогармонов. К фитогормонам, применяемым при культивировании растений, относятся:

Цитокинины (кинетин, БАП – 6-бензиламинопурин, зеатин и др.) нарушают покой и стимулируют рост покоящихся органов, регулируют рост соматических зародышей и формирование растений, необходимы для дифференциации стеблевых почек в культуре каллюсных клеток и при регенерации побегов из клеток эксплантов.

Ауксины (ИМК – индолилмасляная кислота, НУК – нафтилуксусная кислота, 2,4-Д и др.) влияют на деление, растяжение и дифференциацию клеток, стимулируют образование корней.

Гиббереллины (ГК – гибберелловая кислота и др.) способствуют развитию надземной части растений (усиливают рост и вытягивание стебля, листьев, сформировавшихся почек) (Борисенок, 1983; Царев, Погиба, Тренин, 2001).

Выделяют следующие этапы регенерации растений при микроразмножении с целью получения посадочного материала: