1. Ознакомиться с пояснением к заданию;

2. Ознакомиться с культуральными сосудами и инструментами, культуральной лабораторией;

3. Зарисовать основные сосуды и инструменты, применяемые при работе с культурой ткани;

4. Усвоить правила работы с культуральными инструментами;

Материалы и оборудование: стационарная свето-клима-термакамера; набор культурального оборудования – бутыли, колбы, бюксы, стаканы, чашки Петри, стекла, пинцеты, ножи, скальпели, пипетки и др., аптечка.

Вопросы для самопроверки:

1. Условия, необходимые для правильной организации работ по микроразмножению?

2. Какая посуда применяется для приготовления и хранения питательных сред?

3. Необходимый набор посуды для пересадки и выращивания изолированных тканей?

4. Инструменты, применяемые для вычленения и пересадки тканей, и правила работы с ними?

5. Техника безопасности при работе с режущими инструментами?

Лабораторное занятие 2 - Стерилизация

Задание 1- Освоить методы стерилизации помещений и культурального оборудования

Пояснение к заданию:

Изолированные клетка, ткань, орган могут успешно расти на синтетических питательных средах при соблюдении стерильности помещений, где изолируется, пересаживается и выращивается ткань; посуды и инструментов; тканей; питательных сред. Одним из основных условий успешности протекания процесса является ограничение растительных эксплантов от конкуренции с инфекцией. Инфекция, наблюдаемая в культурах тканей, может быть систематической и случайной. Систематическую инфекцию необходимо удалить. Для этого анализируют все операции по стерилизации, изолированию, пересадке тканей, составлению питательных сред с целью обнаружения ошибки и выявления источника инфицирования. При правильном подборе питательной среды от тщательности проведения стерилизующих мероприятий на 90% зависит успех микроразмножения (Шевелуха и др., 1995).

Для работы с культурой ткани выбирают просторные помещения, оборудованные ультрафиолетовыми гермицидными лампами, которые должны работать перед любыми операциями в течение 2 часов или аппаратами для пропаривания водяным паром (срок обработки 2-3 часа). Так же необходима регулярная антимикробная обработка с использованием 70-90 % спирта либо гипохлорита натрия для обезвоживания рабочих поверхностей (Хартман, Кестер, 2002 г.)

Культуральное оборудование и инструменты перед стерилизацией тщательно подготавливают:

- При выращивании культур на полутвердой, агаровой питательной среде, где ткань непосредственно не соприкасается со стеклом, посуда может быть вымыта обычным способом.

- Там, где ткань непосредственно контактирует со стеклом или применяется жидкая среда, посуду моют с применением концентрированной серной кислоты и бихромата калия. Посуду оставляют в растворе на 4 часа, затем дают ему стечь и не менее 10 раз промывают проточной водой, после чего ополаскивают два раза дистиллированной водой.

Паркер рекомендовал кипятить посуду в мыльном растворе, затем промывать теплой проточной водой, споласкивать 96% спиртом, сушить и стерилизовать (приведено по Р.Г. Бутенко, 1964).

Способы стерилизации

1. Стеклянную посуду, инструменты для вычленения и пересадки тканей стерилизуют сухим горячим воздухом в сушильных шкафах в течение двух часов при температуре не менее 140 ⁰С. Металлические инструменты стерилизуют обернутыми в бумагу, при этом за температурой необходимо внимательно следить, так как при 170 ⁰С бумага начинает приобретать коричневый цвет и разрушаться.

2. Чашки Петри, бюксы, ланцеты, пинцеты стерилизуют пламенем - опускают в стакан с 96% этиловым спиртом, а затем обжигают в пламени горелки (рисунок 2.1).

3. Иглы, шприцы, пробкобуры, ножницы стерилизуют кипячением в колбе с дистиллированной водой, помещая на 1 час в автоклав под давлением 1 атм (Бутенко, 1971 и др.).

После выделения эксплантов все инструменты нужно тщательно очищать и стерилизовать.

Рисунок 2.1 – Стерилизация пламенем инструмента для вычленения и пересадки тканей