4.3.Практичні роботи

1.Визначення групи крові за системою АВО за допомогою цоліклонів.

2.Визначення загального часу зсідання крові

3.Визначення ретракції згустка.

Робота №1. Визначення групи крові за системою АВО за допомогою цоліклонів.

Для визначення групи крові в будь-якій системі використовують один і той же принцип: забезпечують умови для здійснення реакції аглютинації еритроцитів у середовищі стандартних ізогемаглютинуючих сироваток або цоліклонів, що мають високий титр антитіл до досліджуваних антигенів еритроцитів. Стандартні сироватки – це очищена в фабричних умовах плазма донорів різних груп крові, що не містить фібриногену та має високу концентрацію антитіл до одного або кількох антигенів однієї групової системи.

Цоліклони анти-А і анти-В являють собою порошок, що містить специфічні імуноглобуліни, тобто антитіла, аглютиніни, які діють проти групових антигенів А і В. Ці антитіла утворюються одноклональними В-лімфоцитами у мишей при введенні в їх організм антигенів (А або В) у вигляді злоякісних специфічних клітин.

У цоліклонах є антитіла тільки однієї специфічності. Це означає, що вони дають реакцію лише на 1 антиген, тобто не зумовлюють неспецифічної поліаглютинації еритроцитів. Ці їх властивості забезпечують перевагу перед стандартними сироватками, які важко очистити від інших антитіл і тому можливі неспицифічні реакції з антигенами досліджуваної крові.

Мета роботи: визначити групу крові за системою АВО.

Для роботи потріібні: біла фарфорова тарілка, 7 маркірованих піпеток, предметне скло, олівець-склограф, кров та плазма обстежуваного, закриті посудини з розчинами цоліклонів анти-А та анти-В, стандартні еритроцити ІІ(А) та ІІІ(В), ізотонічний розчин натрію хлориду.

Хід роботи. Суху фарфорову тарілку розділити на 4 сектори склографом. Зробити написи “анти-А”, “анти-В”, “стандарт А”, “стандарт В”. За допомогою відповідно маркірованих піпеток по черзі нанести на поверхню тарілки у відповідний сектор по одній (0,1мл) краплі цоліклонів анти-А та анти-В. Простежити, щоб не було бризок до сусідніх секторів. Цією ж піпеткою зробити краплю плоскою (не менш 1,5-2 см у діаметрі).

Одну краплю досліджуваної крові за допомогою відповідно маркірованої піпетки помістити на сухому предметному склі. Куточками другого сухого предметного скла перенести частину крові(0,01мл) в обидві краплі цоліклонів. Куточки скла для різних цоліклонов мають бути різними. Кров одразу розмішати з краплею цоліклона цим же куточком предметного скла. Співвідношення крові й цоліклона повинно бути 1:10 (змішана крапля має слабко-рожеве забарвлення). Спостереження за перебігом реакціі провести, погойдуючи тарілку протягом 2,5 хв.

Оцінка результатів та контроль.

1.Аглютинаціі нема ні з цоліклоном анти-А, ні з цоліклоном анти-В. Отже, можна припустити, що досліджувані еритроцити не містять антигенів А і В, а кров належить до групи I (0,,).Для підтвердження цього треба провести контроль на присутність у цій крові аглютинінів  і .

Для проведення контролю треба за допомогою маркірованої піпетки нанести по 1 краплі плазми досліджуваного в сектори з написами “стандарт А” і “стандарт В”. Зробити краплі плоскими (діаметром 1,5-2 см). Краплю крові зі стандартними еритроцитами групи II(A) помістити на предметне скло. Кутом другого предметного скла паренести частину крові в краплю плазми, що міститься в секторі “стандарт А”. Співвідношення крові й плазми становить 1:10. Так само змішані стандартні еритроцити групи III(B) з плазмою досліджуваного в секторі з написом “ стандарт В”. Якщо буде реакція аглютинаціі в обох краплях плазми, то можна з певністю говорити, що кров обстежуваного належить до групи I (0, ,) і містить в собі аглютиніни  і .

2. Аглютинація відбулася лише з цоліклоном анти-А. Отже, можна припустити, що досліджувана кров, власне,її форменні елементи, містять лише антиген А і кров належить до групи II(A,). Для підтвердження цього треба провести контроль з метою виявлення аглютинінів у плазмі обстежуваного.

Для проведення контролю за допомогою маркірованої піпетки треба нанести по 1 краплі плазми на тарілку в секторах з написом “стандарт В” і “ стандарт А”. Змішати плазму й стандартні еритроцити II (A) і III (B) за описаною вище методикою. Якщо аглютинация відбувається у секторі “стандарт B ” і не проявиться у секторі “стандарт А”, то це свідчить про те, що в плазмі є аглютиніни  і нема аглютинінів . Отже, можна стверджувати, що кров належить до групи II (A,).

3. Аглютинація відбулася тільки з цоліклоном анти-В. Отже,можна припустити, що досліджувані еритроцити містять лише антиген В і кров належить до групи ІІІ(В, ). Для підтвердження цього слід провести такий же контроль, як у попередніх випадках. Якщо реакція аглютинації відбудеться у секторі “стандарт А” і не відбудеться у секторі “стандарт В”, то можна стверджувати, що кров досліджуваного належить до групи ІІІ(В, ).

4. Аглютинація еритроцитів спостерігається в обох краплях з цоліклоном. Отже, можна припустити, що досліджувані еритроцити містять антигени – А і В, а кров належить до групи IV(AB-). Для підтвердження цього також обов’язковий контроль, який проводять за вищеописаною методикою.

Якщо аглютинації стандартних еритроцитів не буде в обох краплях суміші з плазмою досліджуваного, то це означатиме, що плазма не містить антитіл  і . Отже, кров досліджуваного належить до групи IV(AB-).

При проведенні проб треба пам’ятати, що всі явища, які відбуваються у краплях більш ніж за 2,5 хв від моменту змішування, не будуть пов’язані зі специфічною аглютинацією, котра визначається у досліджуванні, а можуть мати різні причини.

Несправжня аглютинація еритроцитів може бути тоді, коли вони збираються у монетні стовпчики. Цю аглютинацію легко відрізнити від справжньої, якщо додати до 1 краплі крові 1 – 2 краплі ізотонічного розчину натрію хлориду. У даному разі несправжня аглютинація зникне.

Рекомендації щодо оформлення результатів роботи. Описати у формі пропонованої таблиці результати аглютинації з цоліклонами анти-А і анти-В, а також результати контролю.

Група крові	Реакція еритроцитів з цоліклоном анти-А анти-В	Реакція плазми зі стандартними еритроцитами груп Станд.А станд.В	Досліджувана кров належить до групи
I II III IV	- + - + + +	+ + + + - - -

У висновках відповісти на запитання,

Про що свідчить наявність\відсутність аглютинації досліджуваної крові з цоліклонов анти-А?

Про що свідчить наявність\відсутність аглютинації досліджуваної крові з цпликлоном анти-В?

Про що свідчить наявність\відсутність аглютинації стандартних еритроцитів А з плазмою крові досліджуваного?

Про що свідчить наявність/відсутність аглютинації стандартних еритроцитів В з плазмою крові досліджуваного?

До якої групи за системою АВО належить кров обстежуваного?

Робота № 2. Визначення загального часу зсідання крові.

Мета роботи: визначити загальний час зсідання крові та оцінити його.

Для роботи потрібні: предметне скло, скляний гачок, годинник, голка, 96% етиловий спирт, 2% розчин йоду спиртовий, вата.

Хід роботи. З хвоста щура взяти кров і нанести на предметне скло краплю крові і одномоментно засікти час. Витягуючи гачком вміст краплі з інтервалом 20 – 30 с (гачок треба тримати вертикально), почекати, доки за гачком потягнеться тонка прозора нитка фібрину. Знову засікти час і вважати цей момент початком зсідання. Потім, також зануривши гачок у краплю крові, потягувати вміст краплі горизонтально по склу з тим же інтервалом. Як тільки за гачком потягнеться згусток, засікти час, що відповідає закінченню процесу зсідання.

Рекомендації щодо оформлення результатів роботи. Записати час початку та кінця зсідання.

У висновках відповісти на запитання, чи нормальний загальний час зсідання крові?

Робота № 3. Визначення ретракції згустка.