Тема 7. Производство противобактериальных

ВАКЦИН И ДИАГНОСТИКУМОВ

Современная промышленная технологическая линия

производства живой сухой вакцины против рожи свиней

из штамма ВР-2 (ОАО Омский биокомбинат, Ставропольская биофабрика).

Промышленная технология производства представлена на примере живой сухой вакцины из штамма ВР-2 против рожи свиней.

При культивировании штамма ВР-2 в биореакторе его биологические свойства не изменяются и соответствуют требованиям инструкции или регламента.

Термическая стерилизация питательной среды (125 °С) удлиняет время культивирования и уменьшает концентрацию микробных тел возбудителя рожи свиней.

В процессе хранения каждой серии жидких вакцин из штамма ВР-2 значительная часть микробных клеток отмирает. Лиофилизированные вакцины более стандартны, так как имеют в прививной дозе определенное количество микробных тел. Известно, что препараты с мелкими частицами сорбента более иммуногенны, чем препараты с крупными частицами (хлопьями).

Уплотнение частиц приводит к тому, что антиген, связанный с сорбентом, не усваивается организмом и не обеспечивает создание длительного и напряженного иммунитета.

Современная промышленная технология производства вакцины из штамма ВР-2 учитывает недостатки ранее существующей технологии по составу питательной среды и методу их стерилизации, среде высушивания режимов культивирования и концентрирования.

Штамм. Эталонный сухой стандартный заражающий Erysipelothrix rhusiopathiae вакцинный штамм ВР-2 возбудителя рожи свиней получают в высушенном виде в ампулах из ВГНКИ.

Питательная среда. Культивирование штамма Erysipelothrix rhusiopa-thiae ВР-2 при производстве вакцины против рожи свиней осуществляется на питательной среде на основе перевара Хоттингера и печеночного экстракта с содержанием следующих компонентов: пептон; сухой дрожжевой экстракт; NaCl; KH₂ PO₄; Твин-80; глюкоза; нормальная сыворотка крупного рогатого скота; L-аргинин.

Среда высушивания. При изготовлении живой сухой вакцины против рожи свиней из Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 при сублимационной сушке используется среда высушивания на основе фосфатно-буферного раствора с содержанием следующих компонентов: желатин, пептон, сахароза.

Блок-схема технологической линии производства вакцины против рожи свиней приведена на рис. 5.

1

7

3

4

6

8

9

10

2

5

Рис. 5. Блок-схема техно-

логии производства вак-

11

цины против рожи свиней

(И.В. Тихонов, 2005)

Для промышленного культивирования используют вакцинный штамм

ВР-2 (1). Культивирование матровой расплодки осуществляется на мясо-пептонном бульоне (2) в 100 мл флаконах (по 2 флакона на 1 ампулу (3), затем пересевают в 100 мл флаконы с полужидким МПБ. Культуру посевной серии пересевают в 3-х л бутыли (4).

Посевную культуру (4) засевают в простерилизованный биореактор (6), в который предварительно подают питательную среду на основе перевара Хоттингера (11): перевар Хоттингера - 25 - 30%; печеночный экстракт - 5%; пептон - 5%; сухой дрожжевой экстракт 0,5%; NaCl - 0,2%; KH₂ PO₄ - 0,3%;

Na₂HPO₄ - 1,8%; Твин-80 -0,05%; глюкоза - 0,2%; нормальная сыворотка крупного рогатого скота - 2%; L-аргинин - 0,05%; дистиллированная вода до 100%.

Концентрация пептона в предлагаемой среде составляет 5%, что позволяет обеспечить бактерии рожи источником азота, который необходим для синтеза белковых соединений и формирования протоплазмы.

В состав среды в качестве источника углерода вводится глюкоза, которая при расщеплении в форме АТФ используется микроорганизмами как источник энергии.

Кроме того, для улучшения ростовых свойств питательной среды добавляется аминокислота L-аргинин и нормальная сыворотка крупного рогатого скота (КРС).

Для сохранения ростовых свойств питательной среды используется метод холодной стерилизующей фильтрации с применением патронного микрофильтра (5) типа КФО-1 («Карлсон Форд», Англия) с фильтрующим материалом, состоящим из композита целлюлозы с минеральными волокнами.

В биореактор (6) загружают питательную среду из расчета 2/3 рабочего объема биореактора, а засевная доза составляет 3 - 5% к объему питательной среды.

Глубинное культивирование проводят при температуре (36 ± 0,5) в течение 20 - 22 ч при постоянном перемешивании (100 - 150 об/мин), что обеспечивает поддержание парциального давления растворенного кислорода (рО₂) на уровне 40 - 50 % от насыщения. После окончания культивирования в отдельно взятой пробе из биореактора определяют оптическую концентрацию культуры, которая должна находиться в пределах (7 ± 2) млрд/мл.

Затем в биореактор с культуральной жидкостью добавляют среду высушивания из расчета 1:4 на основе фосфатно-буферного раствора (7).

Для повышения качества и сроков хранения сублимационно высушенной противорожистой вакцины концентрация пептона, как одного из наиболее термозащищающих веществ, доводится до 15%. Концентрация желатина, обладающая меньшими защитными свойствами, с целью снижения количества, балластных веществ уменьшена до 4 %. Для повышения стабильности вакцины при высушивании и хранении концентрация сахарозы увеличена до 20%.

Применение предложенной среды высушивания позволяет повысить выживаемость культуры бактерий рожи при сушке до 70 - 75% и увеличить сроки хранения с 6 месяцев до 1 года.

Среду высушивания перемешивают с культуральной жидкостью при 200 - 300 об/мин в течение 15 мин. После этого бактериальную суспензию перекачивают в емкость для расфасовки, выдерживают при температуре (6 ± 2) °С в течение 1-3 сут, до получения предварительных результатов исследований на чистоту культуры (8). После этого ее передают на фасовку в 20 мл флаконы (9), а затем - на лиофилизацию (10).

Аппаратурно-технологическая схема линии производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 приведена на рис. 10.2.

Контроль вакцины. Вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2 живая сухая должна соответствовать требованиям технических условий и изготовляться согласно «Инструкции по изготовлению и контролю вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 живой сухой».

По физико-химическим и биологическим свойствам вакцина должна соответствовать требованиям и нормам.

Упаковка и маркировка. Бактериальную культуру вакцинного штамма

ВР-2 после контроля типичности и чистоты роста, соединенную в соотношении 1:1 - 1:4 со средой высушивания, расфасовывают по 10 см³ ± 3% в чистые стерильные флаконы вместимостью 20 мл, установленные в кассеты, предварительно укупоривают пробками УJI-1, подвергают замораживанию и лиофилизации.

Показатели качества вакцины приведены в табл. 11 Таблица 11.

Показатели качества вакцины (И.В. Тихонов, 2005)

Наименование показателя	Характеристика и норма
1	2
Внешний вид	Сухая мелкопористая масса
Цвет	Беловато-желтый
Наличие посторонней примеси, плесени, следов оттаивания, трещин флаконов	Не допускается
Растворимость	Вакцина должна полностью растворяться в физиологическом растворе в течение 1-3 мин.
Массовая доля влаги, %	1,6 – 4,0
1	2
Контаминация посторонней микрофлорой и типичность роста	Вакцина не должна быть контаминирована посторонней микрофлорой. При посевах на МПА через 24 – 48 ч вакцинный штамм должен расти с образованием бесцветных, гладких, прозрачных колоний на МПБ через 24 ч – равномерное помутнение
Количество доз во флаконе	25, 50, 100, 150, 200 доз в одном флаконе из расчета 200 млн в 1 мл микробных клеток в одной иммунизирующей дозе
Погрешность фасования, %	±3
Безвредность	Вакцина должна быть безвредной
Иммуногенная активность	Вакцина должна быть иммуногенной
Массовая доля кислорода, % не более	1,0

Окончательное укупоривание флаконов осуществляется с помощью прижимной плиты в атмосфере азота. После этого флаконы с вакциной закатывают колпачками.

На флаконы с вакциной должны быть наклеены этикетки с указанием наименования предприятия-изготовителя, наименования препарата, номера серии и контроля, дозы препарата, даты изготовления, срока годности.

Статистические показатели промышленного производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 по 30 сериям приведены в табл.12.

Широкое распространение возбудителя в природе является одной из существенных сторон его биологии, что обусловливает возникновение заболевания почти повсеместно в виде спорадических случаев и эпизоотических вспышек, представляя в отдельных хозяйствах серьезную проблему.

Таблица 12.

Показатели промышленного производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2(И.В. Тихонов, 2005)

pH (ед.рН)				Аминный азот (мг%)
7,5±1				175±5
б) Посевной материал
рН (ед.рН)				Оптическая концентрация, млрд/мл
6,8±1				6,0±1
в) Культивирование
Характеристика культуральной суспензии		Время культи- вирования (час)	Характеристика культуральной суспензии по окончанию культивирования					Культуральная суспензия: среда высушивания, объем		Исходный продукт перед лиофилизацией
рН (ед.рН)	оптиче-ская концен- трация, млрд/мл		рН (ед. РН)		оптическая концентра- ция, млрд/мл		рН (ед.рН)			Оптиче-ская концент-рация, млрд/мл
7,5±1	0,2±0,5	21±1	6,8±1		6.±1		1:4		6,8±0,5		4±1,0
г) Сухая живая вакцина после сублимационного высушивания
Серия, объем		Количество флаконов,шт.	В продукте							Доз во флаконе
Л		(в 20 мл по 10 мл)	рН			количество живых клеток млрд./мл
50		5000	6,5±0,5			3±1,0				150±50

Распространенность эризипелотрикса в природе не зависит от заболеваемости свиней.

При создании новых высокоэффективных противорожистых препаратов следует уделять внимание разработке сухих вакцин. Они стандартны, устойчивы при хранении.

Схема специфической профилактики молодняка требует совершенствования, так как осуществление принятой в промышленном свиноводстве схемы вакцинации даже в самом жестком варианте (при угрожающей эпизоотической обстановке) не вызывает накопления достаточных титров антител у молодняка до 3-х мес. возраста.

Традиционные методы и схемы индивидуальной иммунизации свиней в крупных промышленных комплексах достаточно сложны, трудоемки, дороги и в эпизоотическом отношении недостаточно эффективны. В настоящее время назрела необходимость разработки и внедрения методов групповой вакцинации животных.

Приведенные данные свидетельствуют о широком круге проблем по данному вопросу. Ликвидация рожи свиней во многом зависит от разработки новых методов профилактики, диагностики и лечения, от внедрения новых систем ветеринарно-санитарных, противоэпизоотических мероприятий и использования современного автоматизированного оборудования в линиях производства вакцины.

Производство бактериальных антигенов-

диагностикумов

Исследования сывороток больных животных на наличие в них антител, а также определение титров антител в специфических сыворотках при их промышленном изготовлении осуществляется с помощью антигенов-диагностикумов.

При изготовлении бактериальных антигенов используют или живые культуры или взвеси убитых микроорганизмов.

Приготовление диагностикумов связано, прежде всего, с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов, из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабельность, специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси.

Чаще всего для получения диагностикумов определённые штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры бактерий смывают с поверхности агара, а затем их инактивируют 0,5%-м раствором формалина (бруцелёзный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллёзный, коли-антигены), нагреванием (бруцеллёзный антиген) и другими методами.

Антигены бывают корпускулярными и растворимыми.

Корпускулярные антигены представляют собой взвесь убитых (реже - живых) бактерий в физиологическом растворе с определённой концентрацией консерванта.

Во всех случаях антигены подвергают высокой степени очистки. Такие антигены используются для постановки РА, РСК, РДСК.

Примером получения корпускулярного антигена является изготовления листериозного антигена для РСК из производственных штаммов листерий двух серогрупп (по 2 штамма на серогруппу).

Штаммы листерий выращивают на мартеновском агаре при температуре 37° С раздельно в течение 24 - 48 ч до получения обильного; роста. Культуры выросших микроорганизмов центрифугируют в течение 20 мин при 2000 об/мин. Осадок листерий подвергают экстрагированию сначала спиртом, а затем смесью спирта и эфира. После этого опять производят осаждение биомассы листерий центрифугированием. Такую обработку антигена повторяют несколько раз. В конечном итоге листерий консервируют 1%-м раствором борной кислоты, доведя концентрацию микробной взвеси до 50 млрд/мл. Готовый антиген разливают в ампулы и подвергают контролю.

Растворимые антигены чаще всего готовят в виде экстрактов из агаровых культур микроорганизмов. Они используются для РСК при сапе, бруцеллёзе, инфекционном эпидидимите баранов и других заболеваниях, а также при постановке диагноза с применением реакции иммунодиффузии (РИД) на бруцеллёз и другие инфекции.

О-диагностикумы готовят обычно из неподвижных вариантов культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином.

Сальмонеллёзные Н-диагностикумы готовят из бульонных или агаровых культур путём добавления к ним формалина, но не более 0,1- 0,3 %-ной его концентрации. Наиболее трудно приготовить Vi-антиген, т.к. он обладает малой устойчивостью к различным воздействиям, в том числе и к формалину. Готовится он из поверхностных |компонентов микробных клеток, стабилизируется 25 %-м раствором хлорида кальция и консервируется формалином.

Чтобы повысить эффективность диагностики в системе организации противоэпизоотических мероприятий, необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, пригодных к использованию в лабораторных условиях. Для этого готовят корпускулярные антигены, окрашенные какими-либо красителями. Например, постановки пластинчатой реакции агглютинации на бруцеллёз в настоящее время широко применяют антиген, представляющий взвесь буферном растворе микробных клеток Br.abortus 19, инактивированных нагреванием и фенолом и окрашенных бенгальской розовой в малиново-розовый (розбенгал-проба).

При постановке диагноза на бруцеллез для кольцевой реакции с молоком используется антиген в виде взвеси инактивированных нагреванием бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет.

При диагностике пуллороза-тифа птиц при постановке кровекапельной реакции агглютинации (ККРА) на стекле используют цветной антиген, представляющий собой гомогенную взвесь микробных клеток S.gallinarum, убитых формалином и окрашенных генцианвиолетом.

Эритроцитарные диагностикумы. При некоторых инфекционных заболеваниях (бруцеллез, пуллороз, колибактериоз, пастереллез и др.) рекомендуются и производятся промышленным способом эритроцитарные диагностикумы.

Такие антигены (сальмонеллез) представляют собой 5-10 %-ю взвесь эритроцитов барана, сенсибилизированных полисахаридно-полипептидной фракцией соответствующих возбудителей болезни. Они предназначены для прижизненной диагностики болезней с применением реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Или (колибактериоз) - 2,5%-ная взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенным комплексом, полученным путем экстракции солянокислым гидроксиламином из клеток бактерий рода E.coli.

Для получения полисахаридно-полипептидной фракции проводят гидролиз бактерийной массы бактерий уксусной кислотой и осаждают ее этиловым спиртом.

Кровь для получения эритроцитов берут стерильно из яремной вены барана в сосуд со стерильным раствором Олсевере. Эритроциты несколько раз отмывают стерильным фосфатным буфером, центрифугируют, консервируют формалином и ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Затем их сенсибилизируют полисахаридно-полипептидной фракцией сальмонелл. Сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатным буфером с формальдегидом до 10%-ной концентрации, расфасовывают во флаконы и сдают на контроль.

Эритроцитарный антиген контролируют на активность, специфичность, стерильность, концентрацию эритроцитов и рН.

Приготовление аллергенов.

Туберкулин. Впервые туберкулин был получен и применен в ветеринарной практике в России в 1988 г. Гельманом Х.И., затем для медицинских целей изготовлен Р.Кохом в 1890 г. Для диагностики туберкулеза отечественная биопромышленность выпускает несколько видов аллергенов: сухой очищенный ППД-туберкулин (Purified Protein Derative) - для млекопитающих, сухой очищенный ППД-туберкулин для птиц, альттуберкулин (АТК), КАМ-туберкулин, стандартный раствор ППД-туберкулина для млекопитающих.

Для приготовления ППД-туберкулина и альттуберкулина для диагностики туберкулеза млекопитающих используют производственные штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида.

1. Производственные штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида выращивают в модифицированной среде Соттона с аспарагином и лимонной кислотой в течение 2 месяцев.

2. Автоклавируют взвесь микобактерий.

3. Белок культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой.

4. Центрифугируют и повторно осаждают белок сернокислым аммонием.

5. Надосадочную жидкость удаляют, а преципитат растворяют в воде и подвергают диализу для удаления остатков сернокислого аммония.

6. Раствор туберкулина подщелачивают и фильтруют.

7. Расфасовывают во флаконы объемом 10 - 20 мл и лиофильно высушивают.

8. Проводят контроль туберкулинов на растворимость, стерильность, рН, безвредность, специфичность и содержание туберкулиновых единиц (ТЕ). Активность выпускаемых серий ППД должна составлять 50000 ТЕ/мл.

Туберкулин представляет собой лиофильно высушенные белковые продукты метаболизма микобактерии и белки, извлеченные из клеток.

Комплексный аллерген из атипичных микобактерии (КАМ) готовят по типу ППД-туберкулинов для млекопитающих и птиц.

В качестве производственных штаммов используют наиболее часто мигрирующие на животноводческих фермах нефотохромогенные и скотохрамогенные микобактерии (штаммы Мус. Serofulaccum-12 и Мус. intracellulare-13). Культуры этих штаммов поддерживают па картофельной среде Павловского и для изготовления аллергена адаптируют к синтетической питательной среде. Из 2-месячных культур готовят растворы моноаллергенов. Затем растворы моноаллергенов смешивают в разных количествах по содержанию ЕД и лиофилизируют. Комплексный аллерген выпускают во флаконах вместимостью 10 мл с содержанием 67500 ЕД.

Бруцеллин. Для приготовления бруцеллина используют производственный штамм Вг. abortus В-1.

1. Производственный штамм В. abortus B-1 в S-форме и не вызывающий образования агглютининов при подкожном введении морским свинкам выращивают в биореакторе в питательной среде с 0,5%глюкозы при 37 °С в течение 4-5 сут.

2. Культуру бруцелл прогревают до 105 - 110°С при работающей мешалке, затем охлаждают и центрифугируют.

3. Надосадочную жидкость (конденсат бруцеллина) фильтруют через стерилизующие пластины и собирают в стерильную емкость.

4. Бактерийную массу разбавляют физраствором 1:50 и стерилизуют при 105-110°С.

5. Надосадочную жидкость (экстракт бруцеллина) после стерилизующей фильтрации смешивают с ранее полученным концентратом, смесь разводят стерильным физраствором до необходимой концентрации бактериального белка, доводят рН до 7,2 -7,4.

6. Приготовленную серию бруцеллина разливают во флаконы, закрывают пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками.

7. Флаконы стерилизуют в автоклаве при 105-110°С и выдерживают 3 сут в термостате при 37 °С.

Конечный продукт - бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную жидкость светло-коричневого цвета, содержащую продукты жизнедеятельности (метаболизма) бруцелл и специфические вещества белковой природы, извлеченные из них.

Готовый препарат подвергают контролю на стерильность, содержание бактериального белка, концентрацию водородных ионов, безвредность, специфичность и активность.

Маллеин. Для изготовления маллеина используют штамм № 5584 возбудителя сапа.

1. Actinobacillus mallei № 5584 выращивают в мясо-пептонном глицериновом бульоне (МПГБ) в бутылях в течение 4 месяцев при 37°С.

2. Культуральную суспензию автоклавируют и отстаивают в течение 4 мес. при 20 °С.

3. Надосадочную жидкость фильтруют через стерилизующие пластины.

4. Разливают в ампулы или флаконы, которые после закупорки стерилизуют автоклавированием.

5. Готовый препарат контролируют на стерильность, безвредность и специфичность.

Вышеизложенная технология получения бруцеллина, туберкулина, маллеина показывает, что несмотря на ряд технологических различий в их изготовлении, имеются и некоторые общие процессы. Эти препараты представляют собой культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма, автолизаты и экстракты возбудителей соответствующих заболеваний, подвергнутые автоклавированию.

Применение таких диагностических препаратов позволяет эффективно проводить противоэпизоотические мероприятия по ликвидации в стране бруцеллеза, туберкулеза, недопущению заболевания сапом животных и людей.

Технология приготовления бактериофагов

Технология приготовления бактериофагов, в основном, аналогична технологии приготовления вирусных препаратов, только вместо эукариотов используются бактериальные клетки, в которых бактериофаги размножаются.

Высокая специфичность некоторых штаммов бактериофагов позволяет использовать их для диагностики инфекционных заболеваний и индикации патогенных микроорганизмов. Фагоиндикация позволяет установить природу возбудителя инфекции даже в том случае, когда другие методы, в т.ч. и серологические, оказываются неэффективными.

В последние годы получение бактериофага широко используется как экспериментальная модель в молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и биофизике (рис.6).

Выделение фагов из

лизогенных культур

бактерий

Выделение

фагов из внешней среды

Выделение

фагов от людей и животных

Приготовление суспензии фагов путем смыва их частиц с поверхности

негативной колонии, образовавшейся после лизиса бактерий на плотной

питательной среде

Титрование фага методом агаровых слоев или

методом Аппельмана

Внесение суспензии бактериофага в молодую

культуру бактерий для получения биопрепарата

Очистка биопрепарата от питательной среды

Центрифугирование

Капельный

диализ

Очистка путем

фильтрации в агар

Приготовление концентрированных суспензий бактериофагов

Расфасовка, упаковка, маркировка

Контроль

Рис.6. Технология получения бактериофагов

Выявление фаговых частиц и определение их количества. Если к растущей в жидкой среде культуре чувствительных бактерий добавить небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то бактериальные клетки окажутся зараженными. В течение некоторого времени никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1ч, а иногда и более (длительность его зависит от природы фага и бактерии, а также от условий культивирования). Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток.

При лизисе клетки из нее высвобождается большое количество новых фаговых частиц. Эти частицы могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, и при этом вновь повторяется тот же самый процесс. Следовательно, если в культуру внести даже небольшое (по сравнению с количеством бактериальных клеток) число инфекционных фаговых частиц, то через несколько часов практически вся популяция бактерий будет уничтожена.

Число фаговых частиц или зараженных бактериальных клеток в суспензии легко определить, если подходящее разведение этой суспензии нанести на чашку с агаром, поверхность которого равномерно покрыта разбавленной суспензией чувствительных бактерий. После соответствующей инкубации вся поверхность чашки будет покрыта сплошным слоем бактерий, за исключением тех мест, где оказались частицы фага или зараженные клетки. В результате последовательных циклов развития фага пленка бактерий вокруг таких точек локально разрушается и образуются прозрачные зоны лизиса – бляшки

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то с помощью соответствующих методов их можно разделить (используя, например, дифференциальное центрифугирование) и затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других.

Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому бактериофаги устойчивы.

Выделение и очистка бактериофагов. Метод подсчета числа бляшек может быть использован для выделения тех фагов, которые способны развиваться в определенных видах или штаммах бактерий. Для этого пробу материала из природного местообитания такой бактерии встряхивают с водой, освобождают эту суспензию от бактерий, ее через мембранный фильтр или обрабатывая хлороформом, аликвоты смешивают с суспензией данной бактерии и высевают на чашки с агаром.

Любая бляшка, которая выявляется на чашках, соответствует присутствовавшей в природном материале фаговой частице. Фаг из отдельной бляшки можно выделить, прикоснувшись к ней стерильной иглой и суспендировав прилипший к игле материал в небольшом объеме стерильного раствора. Обычно в такой суспензии оказывается от 10⁴ до 10⁶ фаговых частиц. Затем проводят очистку фага, последовательно повторяя такое выделение из отдельной бляшки.

Для получения больших количеств фага для химического или физического исследования заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры, лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 10⁹ до 10¹² фаговых частиц на 1 мл, а также растворимый материал и фракцию частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактериофагов обычно используют ультрацентрифугирование. Даже самые мелкие фаговые частицы осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 10⁵ раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частницы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Контроль фаговых препаратов проводят на чистоту, активность и специфичность.

Стерильность бактериофагов проверяют высевом на питательные и культивируют в термостатах при 37⁰С (для выявления бактериальной микрофлоры) и при 24 °С (для выявления грибковой флоры). Препарат считают годным, если через 8сут во всех средах не обнаруживают рост микроорганизмов. При выявлении роста бактерий или грибов хотя бы в одной пробирке проводят повторный контроль из удвоенного количества образцов. При повторном проросте сред препарат бракуют.

Активность и специфичность бактериофагов устанавливают на жидких и твердых питательных средах титрованием с соответствующим видом бактерий.

Если результаты проверки не соответствуют требованиям инструкций по изготовлению и контролю, то такой препарат не подлежит выпуску.

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИКОВ

Пробиотики широко используются в ветеринарии для стимуляции роста и развития молодняка животных, профилактики желудочно-кишечных заболеваний, восстановления кишечного биоценоза при стрессах, антибиотикотерапии. Пробиотики являются экологически чистыми препаратами, не оказывают побочного эффекта при длительном и регулярном их применении и могут заменить антибиотики в общей схеме неспецифической профилактики желудочно-кишечных болезней (табл. 13).

Таблица 13.

Возможные механизмы действия пробиотиков.

1.Подавление роста живых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов а) продукция антибактериальных компонентов б) конкуренция за источники питания в) конкуренция за рецепторы активности

2.Влияние на микробный антагонизм а) уменьшение ферментной активности б) увеличение ферментной активности

3.Стимуляция иммунитета а) увеличение уровня антител б) увеличение активности макрофагов

Эффективность применения различных пробиотиков широко варьирует и зависит от многих факторов, в том числе и от видового состава входящих в них микроорганизмов. Большинство известных в мировой практике пробиотиков содержит несколько видов бактерий-симбионтов, сочетание биологических свойств которых позволяет повысить эффективность препаратов. К числу наиболее известных относятся молочнокислые бактерии, бифидобактерии, стрептококки.

В последние годы в состав пробиотических препаратов все чаще включают аэробные спорообразующие бактерии, относящиеся к роду Bacillus, большинство представителей которых обладает антагонистическими, протеолитическими свойствами и способностью к выработке широкого спектра антибиотикоподобных субстанций (табл.14).

Кроме перечисленных видов бактерий, в ряде стран в составе про-биотиков для животных широко используют Saccaharomyces Icerevisiae, Candida pintolopesii, Aspergillus niger и Aspergillus orysae.

Таблица 14.

Пробиотические препараты, выпускаемые в странах-членах ЕС и исполь-зуемые в них виды микроорганизмов

Препарат	Страна производитель	Виды микроорганизмов
1	2	3
Жидкое ацидофильное молоко, продукты класса йогуртов	Повсеместно	L.acidophilus,B.bifidum, B.longum
Биоград, Бифийогурт, Йога-Лайн, Лактоприв, Эугалин, Витацидофилюс, Омнифлора, Мутафлор, Коливит, Симбиофлор, Лактана –Б	Германия	L.acidophilus, S.thermophilus, B.longum, B.bifidum, E.Coli
Геофилак, Бактолак	Финляндия	L.rhamnosum,L.casei,S.faecium
Йокульт, Бифидер, Тойоцерин, Лакрис, Грауген, Кальспорин, Миаризан, Кородак, Биофермин, Балантол, Лактофед	Япония	L.rhamnosum,L.casei, E.Coli, B.cereus, L.sporogenes,B.sub- tilis,B. thermophilus,C.buri- Ricum,B.pseudolongum,S.faeca- Lus, L.acidophilus, B.toyo
1	2	3
Биокос	Чехия	B.bifidum, L.acidophilus, P.acidolactus
Синелак, Ортобактер, Бифидиген, Лиобифидус, Пробиомин, Нормофлор, Биолакталь	Франция	L.bulgaricus, L.acidophilus,B. Longum, E.Coli, B. thermophiles, B.bifidum
Инфлоран	Швейцария	B. thermophiles, L.bulgaricus, L.acidophilus
Пионер	Испания	Комплекс кишечной Микрофлоры
Вентракс оцидо	Швеция	L.acidophilus, S.faecium, B. thermophiles
Гастрофарм, Нормофлор	Болгария	L.acidophilus, L.bulgaricus.
Био-Плюс 2	Германия, Дания	B.subtilis,B.licheniformus
Протексин, Припалак	Голландия	L.acidophilus
Бактисубтид	Югославия	B.subtilis,
Эсид-Пак-4, Уэй, Лакто-Сак	США	B. thermophiles, L.acidophilus

Пробиотики на основе молочнокислых бактерий

К молочнокислым бактериям, широко используемым для производства пробиотиков, относятся молочнокислые стрептококки и лактобактерии.

B молочной промышленности для изготовления различных продуктов из молочнокислых стрептококков наиболее часто применяют мезофильные стрептококки S.lactis и S.cremoris, которые относятся к группе гомоферментативных, разлагающих молочный сахар до молочной кислоты. В отдельных случаях они образуют небольшие количества летучих жирных кислот и ацетона; являются активными кислотообразователями, оптимальной температурой их роста является 30°С - для S.lactis и 25°С - для S.cremoris.

Мезофильные гетероферментативные стрептококки (S.paracitrovorus, S.diacetilactis, S.acetoinicus, S.citrovorus) при расщеплении лактозы образуют молочную кислоту, при расщеплении лимонной кислоты образуют диацетил. Оптимальной температурой их роста является 30°С, а для S.citrovorus и S.paracitrovorus - 21 - 25°С.

Кроме мезофильных к молочнокислым стрептококкам относятся и термофильные. Представлены они одним видом - S.thermophilus. Оптимальной температурой их роста является 40 - 45°С. Колонии имеют тёмную зернистую структуру, в мазках клетки крупные, сплющены и располагаются цепочками разной длины. Являются сильными кислотообразователями.

К палочковидным молочнокислым бактериям относятся род Lactobacterium.

К подгруппе термофильных палочек относятся L.bulgaricum и L.acidophilum, применяемые для приготовления кисломолочных продуктов, а также L.helveticum, используемые в сыроделии. Все они являются факультативными анаэробами. Плохо растут на поверхности агаровых сред, лучше в столбике агара. На поверхности плотных сред колонии локонообразные, а в глубине имеют форму кусочков ваты, то есть колонии R-формы. В мазках располагаются одиночными клетками или цепочками. Являются энергичными кислотообразователями (до 300°С), молоко сбраживают за 3 - 5 ч. Оптимальной температурой роста является 40°С (для L.acidophilum - 37°С).

К подгруппе стрептобактерий относятся L.casei и L.plantamm, которые принимают участие в созревании сыра. Они представляют собой палочки разной длины, располагающиеся одиночно, попарно или в виде коротких и длинных цепочек. На плотных средах образуют мелкие круглые колонии (S-формы), иногда с выростом. Оптимальная температура роста около 30°С. Являются слабыми кислотообразователями, не свёртывают молоко. По своим свойствам близки к ароматообразующим стрептококкам.

В настоящее время у всех видов молочнокислых бактерий найдены бактериофаги. Они являются строго специфичными, и поэтому с помощью явления бактериофагии можно дифференцировать молочнокислые бактерии. Основополагающим является то, что бактериофаги нарушают молочнокислое брожение при производстве творога, простокваш, сыров с низкой температурой второго нагревания.

Для более точной идентификации молочнокислых бактерий используют серологические методы. Наиболее приемлемой является реакция преципитации. Установлено, что по этой реакции молочнокислые стрептококки более однородны, чем молочнокислые палочки.

В России чистые культуры молочнокислых бактерий стали применять с 1890 г. Большой вклад в разработку способов приготовления чистых культур, сохранения их в сухом виде и использования к производстве кисломолочных продуктов внёс С.А. Северин.

И.И. Мечников, занимаясь проблемой старости у людей, считал, что молочная кислота и другие продукты обмена молочнокислых бактерий, содержащиеся в простоквашах, подавляют гнилостную микрофлору кишечника и предотвращают преждевременное старение организма.

Однако многочисленные опыты, проведённые позже И.И. Мечниковым, показали, что болгарская палочка, вводимая в организм с простоквашей, не обладает специфической способностью приживляться в кишечнике и исчезает из него вскоре после того, как прекращается пребывание в нём простокваши.

По данным американских учёных (Н. Копелов, Ф. Бирмарк, Л. Кальп, Л. Ретжер, В. Альбус), эта способность в гораздо большей cтепени присуща ацидофильной палочке, как естественному предcтавителю молочнокислых бактерий в нормальном кишечном биоценозе. По природе Lactobacterium acidophilum идентична болгарской палочке, но она уже адаптирована к условиям жизни в кишечнике.

Наряду с молочной кислотой многие кисломолочные продукты содержат специфические антибиотические вещества, подавляющие вредную микрофлору кишечника, в том числе и возбудителя туберкулёза.

Кисломолочные продукты широко применяются как для лечебного питания, так и для лечения людей и животных при ряде заболеваний. Так, кумыс, ацидофильно-дрожжевое молоко применяются при лечении туберкулёза, а ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильная паста - как лечебно-диетические продукты при колитах, дизентерии, диспепсии у людей. Эти же кисломолочные продукты могут быть использованы и для лечения животных, особенно молодняка, при различных желудочно-кишечных заболеваниях.

Кроме того, для лечения молодняка животных при кишечных расстройствах применяются чистые ацидофильно-бульонные культуры (АБК), биобактон, лактобактерин. ацидофилин и другие чистые культуры молочно-кислых бактерий (табл. 15).

Таблица 15.

Метаболиты молочнокислых бактерий и их регуляторные функции

Механизм действия	Биологический эффект
1	2
Молочная кислота
Синергизм сочетания с уксусной, пропионовой, масляной кислотами. Синтез внутри- и внеклеточного лактоферрина	Ингибиция роста условно- патогенных микроорганизмов. Снижение синтеза токсинов у плесневых грибов корма. Ингибиция роста железозависимых бактерий.
Углекислый газ
Поддержание анаэробных условий и высокого пар- циального давления. Акцептор водорода при биосинтезе ацетата из гексозы	Снижение дыхательного потенциала у аэробных кишечных бактерий.
Перекись водорода
Способствует образованию гипотиоцината в бактериаль- ных клетках. Повышение лактопероксидазной активности молока и 1	Токсическое действие на каталазо- положительную микрофлору. Повышению активности колост- 2
молозива. Истощение ферментной системы у каталазозависящих микрорганизмов. Инактивация клеточных энзимов.	рального иммунитета. Снижение синтеза белков, ограни- чение передачи генетической ин- формации, снижение факторов ад- гезии у грамотрицательных бакте-рий.
Лизоцим
Связывание антилизоцимного фактора у энтеропатоген- ных бактерий. Разрушение межклеточных связей у грамотрицательных микроорганизмов. Лизис клеточных стенок грамположительных бактерий.	Повышение фагоцитарной актив- ности макрофагов. Снижение колонизационной актив- ности у грамотрицательных бактерий. Неспецифическая стимуляция мак- рофагального иммунитета.
Бактериоцины
Ограничение синтеза белков. Нарушение процессов транспорта через клеточную мембрану, снижение синтеза ДНК, уплотнение ядерного материала, изменение рибосом и лизосом.	Бактерицидное и бактериостатиче- ское действие. Сдерживание процессов деления бактерийных клеток, нарушение передачи наследственной инфор- мации. Деструкция рецепторных связей. Противоопухолевый эффект.

Особенно важным является применение молочнокислых бактерий на фоне интенсивного лечения людей и животных антибиотиками. Как известно, антибиотики в большинстве своём не имеют избирательного действия на микроорганизмы. Наряду с возбудителями болезней они вызывают гибель нормальной микрофлоры кишечника. В ряде случаев это приводит к дисбактериозам, а иногда и к заболеваниям типа кандидомикоза и других. Применение же молочнокислых бактерий даёт возможность восстановить нормальную микрофлору кишечника.

В настоящее время установлено, что наряду с молочной кислотой, молочнокислые бактерии способны продуцировать антибиотические вещества (бактериоцины), подавляющие рост гнилостных, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Так, S. lactis образуют антибиотик низин, S. cremoris - диплококкцин, L. plantarum - лактолин, L. acidophilum продуцирует антибиотические вещества, подавляющие рост возбудителей дизентирии, брюшного тифа, сальмонеллёза, колибактериоза.

Кроме того, следует знать, что молочнокислые бактерии в процессе размножения образуют ещё и ароматические соединения, придающие продукту приятный вкус и ароматичность (диацетил и ацетальдегид), синтезируют жирорастворимые витамины А, Д, Е, богаты солями кальция, фосфора, магния.

С помощью своих экзоферментов молочнокислые бактерии расщепляют молочный белок с образованием ароматических незаменимых аминокислот - тирозина и триптофана и цистеин.

Продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожения (кумыс, кефир, айран, чал) содержат молочную кислоту, углекислоту, следы спирта (до 0,4-0,6%), которые вызывают сильное сокоотделение пищеварительными железами, что улучшает процесс пищеварения и усвоения человеком пищи или корма животными.

Селекция молочнокислых бактерий. Сырое молоко и молочные продукты издавна используются как источники выделения молочнокислых бактерий. Но молоко не является первоисточником этих бактерий.

Молочнокислые бактерии постоянно встречаются в почве, на растениях (цветах, листьях, стеблях, корневой системе). Чаще они сосредотачиваются в прикорневой зоне растений, а затем поднимаются на их надземную часть.

Впервые молочнокислые бактерии из природных источников растительного происхождения выделил и изучил их свойства В.М. Богданов(1959). Это послужило началом широкого использования отдельных растений для получения производственно-полезных штаммов молочнокислых бактерий.

Питательные среды для молочнокислых бактерий и технология их получения. Для селекции молочнокислых бактерий очень является правильный выбор питательных сред и условий культивирования. Чаще всего для выделения молочнокислых бактерий из природных источников используют стерильное обезжиренное молоко.

При культивировании гетероферментативных молочнокислых бактерий, для которых характерно сбраживание солей лимонной кислоты, в питательные среды добавляются лимоннокислый натрий (1%), а в отдельных случаях и дрожжевой гидролизат (2%). На таких же средах осуществляют культивирование молочнокислых бактерий с целью получения заквасок для производства различных молочнокислых продуктов - творога, сметаны, йогурта, простокваши и др.

Кроме обезжиренного молока, для культивирования молочнокислых бактерий в промышленных условиях с целью получения пробиотиков, применяют гидролизованное молоко. Для этого обезжиренное молоко стерилизуют при температуре 120 °С в течение 10-15 мин и охлаждают до 45°С. Обезжиренное молоко должно иметь слегка кремоватый цвет. Затем устанавливают рН до 7,6 - 7,8 и к обезжиренному молоку добавляют из расчёта на 1 литр 0,5-1 г панкреатита или 2 - 3 г поджелудочной железы. Через несколько минут в молоко добавляют хлороформ из расчёта 5 мл на 1 л. Такую смесь в бутылях, закрытых резиновой пробкой, выдерживают в термостате при 40°С в течение 24ч. В первые часы молоко следует периодически перемешивать. Через 24 ч гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. Такой гидролизат обычно прозрачный, реакция его нейтральная и слабокислая, содержит 110 -120 мг% аминного азота, срок хранения 1-2 недели.

Для приготовления из гидролизата молока питательной среды его разводят деминерализованной водой в отношении 1:1 - 1:2 и устанавливают рН = 6,8 - 7,0. При необходимости вводят различные добавки. Питательную среду стерилизуют при 110° С в течение 30 мин. Это делается для предотвращения образования в среде белково-сахарных комплексов, отрицательно влияющих на рост молочнокислых бактерий.

Технология изготовления биобактона. Биобактон представляет собой лифилизированную культуру ацидофильной палочки, обладающей высокими антибиотическими и кислотообразующими свойствами. Для его приготовления используют обезжиренное молоко или среду на основе гидролизата молока по описанному выше методу. Культивируют L.acidophilum при 37 °С в течение

10-15ч. При этом в процессе культивирования среду периодически нейтрализуют кальцинированной содой, что обеспечивает накопление микробных клеток до 3 млрд/мл (этот процесс автоматизирован). Отделяют микробные клетки ацидофильных бактерий в стационарную фазу, т.е. через 10 - 15 ч культивирования. В этот период микробные клетки являются более активными и стойкими к замораживанию.

Бактериальную массу концентрируют на суперцентрифугах (сепараторах) производительностью 200 - 800 л/ч, работающих при частоте вращения ротора 16000об/мин. Полученный концентрат ацидрфильной палочки обычно содержит 250-300 млрд клеток в 1 г.

Чаще всего биобактон выпускают в лиофильно высушенном виде. В качестве среды высушивания используют молочный обрат с сахаром или сахарозо-желатиновую среду.

Концентрированную биомассу разбавляют средой высушивания 1:6, расфасовывают по флаконам, а затем подвергают лиофильной сушке. После этого флаконы закрывают резиновыми пробками, обкатывают для герметичности алюминиевыми колпачками. Проводят контроль на стерильность, биологическую концентрацию бактерий (количество живых микроорганизмов), антагонистическую активность, влажность и др.

Технология изготовления лактобактерина. Лактобактерин - это пробиотик, выпускаемый отечественной промышленностью. В состав лактобактерина для животных входят 2 вида лактобактерий – L.plantarum и L.fermenti.

Технология производства лактобактерина во многом аналогична биобактану (рис.7).

Приготовление

питательной среды

Подготовка посевного

материала

Культивирование микроорганизмов (2 сут.)

Выделение и концентрирование лактобактерий

Лиофильное высушивание

Придание готовой лекарственной формы

Фасовка, упаковка, этикетирование

Контроль готовой продукции

Рис.7. Схема производства лактобактерина

Контроль качества лактобактерина проводят по таким показателям, как биологическая концентрация, отсутствие посторонней микрофлоры, антагонистическая активность.

Технология производства бифидумбактерина

Бифидумбактерин представляет собой лиофилизированную микробную массу живых бифидобактерий. Бифидумбактерин предназначен для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней у человека и животных.

По внешнему виду препарат представляет собой кристаллическую или пористую массу бежевого или беловато-серого цвета. В состав препарата входят сахароза и желатин, которые являются компонентами стабилизирующей среды высушивания. Препарат выпускают в виде сухой биомассы, лиофилизированной в ампулах или флаконах. Массовая доля влаги сухого препарата должна быть не более 3,5 %.

Все работы, связанные с пересевом, разведением, определением физико-химических характеристик бифидумбактерина, требуют соблюдения стерильности и проводятся в вытяжных шкафах или на лабораторных столах над кюветами, на дно которых помещены коврики, смоченные 10%-ным раствором перекиси водорода.

Технология производства бифидумбактерина включает следующие стадии: приготовление питательных сред, выращивание посевного материала, культивирование, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм, контроль готового препарата.

Приготовление питательных сред. Для культивирования бифидобактерий используют среду Блоурокка или среду на основе гидролизата казеина (гидролизатно-молочную или гидролизатно-дрожжевую).

В состав среды Блоурокка входят агар микробиологический, натрий хлористый, пептон сухой, лактоза, печеночный бульон, цистин. Срок хранения питательной среды не более 7 сут при температуре (20±5)°С.

Срок хранения сред на основе гидролизата казеина не более 72 ч при температуре (20 ± 5)°С.

Стадия выращивания посевного материала. Посевы бифидобактерий инкубируют при температуре (38±1)°С в течение (60±12)ч. Контрольные посевы инкубируют при температуре (22 ± 2)°С в течение 8 сук. При этом получают бифидобактерий 1-ой генерации.

Следующий этап - получение бифидобактерий 2-ой генерации. Засев культуры проводят из расчета 10 % от объема среды. Культура бифидобактерий и контрольные посевы инкубируют при той же температуре в матрасах, что и для посева 1-ой генерации. Общее время также аналогично времени для посевов 1-ой генерации. Контроль посевной культуры проводится при высевании бифидобактерий 2-ой генерации в пробирки с глюкозой, средой Сабура и приготовлении мазка, окрашенного по Граму.

При отсутствии роста в контрольных пробирках и наличии типичного роста бифидобактерий в виде рыхлого зернистого осадка, полученную культуру используют для посева в биореактор.

Культивирование. Культивирование бифидобактерий проводят в биореакторах марки БИОР. После проверки на герметичность и обработки фильтров биореактор стерилизуют при 130°С в течение 90 мин. Затем в него вводят гидролизатно-молочную или казеиново-дрожжевую среду. Засев питательной среды проводят бифидобактериями 2-3-ей генерации.

После культивирования проводят контроль биомассы. Биологическая концентрация бифидобактерий должна быть не менее 10⁸ клеток/мл, посторонняя микрофлора должна отсутствовать, рН = 7,1±0,1.Затем готовят среду высушивания и вводят в биореактор. Биомассу со средой высушивания перемешивают (3 ± 0,5) мин механической мешалкой, разливают в стерильные емкости аппарата «Магнолия» и передают на участок розлива в ампулы.

Сублимационное высушивание биомассы. Розлив биомассы в ампулы производится при постоянном перемешивании. В начале, середине и конце розлива отбирают пробы для определения посторонней микрофлоры и жизнеспособности бифидобактерий, равномерности точности розлива. Заполненную ампулами кассету прикрывают несколькими слоями стерильной марли, металлической крышкой и передают для замораживания в низкотемпературную установку Масс-5, где выдерживают препарат при температуре минус (40 ± 2)⁰ в течение (48 ± 2) ч.

Высушивание проводят при давлении (13,3 ± 0,13) Па и температуре минус (30 ± 4)°С в течение (24 ± 2) ч, далее температуру повышают до + (28+2) °С в течение (16 ±2) ч и выдерживают (20 ± 2) ч.

После окончания процесса высушивания производится запайка ампул. Герметизацию ампул осуществляют не позднее 72 ч после окончания лиофилизации на автомате для запайки ампул в атмосфере азота.

Получение готовой лекарственной формы. Пятой стадией производства бифиндумбактерина является маркировка и упаковка препарата. В помещении контроля производят проверку герметичности ампул и визуальный контроль.

Ампулы, прошедшие контроль и осмотр, отправляют на маркировочную машину, затем укладывают по 10 штук в пачки из картона. В каждую пачку вкладывается инструкция по применению препарата.

Контроль готового препарата осуществляется по следующим по­казателям: физические свойства, внешний вид, отсутствие посторонней микрофлоры, количество живых бифидобактерий в одной дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажность, рН, герметичность.

Технология производства пробиотиков на основе

бактерий рода Bacillus

Во всем мире продолжается работа по созданию новых пробиотиков. Важным арсеналом разработки и совершенствования биопрепаратов являются бактерии рода Bacillus. Свойства некоторых штаммов этой группы бактерий настолько разносторонни, что только за последние годы на их основе разработано более десятка эффективных препаратов (табл. 16).

Таблица 16.

Пробиотики на основе бактерий рода Bacilus

Препарат	Микроорганизм	Страна-производитель
1	2	3
1	2	3
Медицинские
Споробактерии	B.subtilus	Россия
Бактиспорин	B.subtilus	Россия
Биоспорин	B.subtilus, B.licheniformus	Украина
Гинеспорин	B.subtilus	Украина
Энтерогермин	B.subtilus	Италия
Флонивин	B.subtilus	Югославия
Бактисубтил	B. cereus	Франция
Цереобиоген	B. cereus	Китай
Ветеринарные
Энтеробактерин	B.subtilus	Россия
Биод-5	B.subtilus, B.licheniformus	Россия
Бактерин-СЛ	B.subtilus,B.licheniformus	Украина
Эндоспорин	B.subtilus	Украина
БПС-44	B.subtilus	Украина
Глоген-8	B.natto	США
Прималас	B.subtilus	Нидерланды
Протексин	B.subtilus	Нидерланды

Важнейшими свойствами некоторых штаммов бацилл являются: антагонистическая активность ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам; высокая ферментативная активность, позволяющая существенно регулировать и стимулировать пищеварение; противоаллергенное и антитоксическое действия и ряд других.

Именно такими свойствами обладает медицинский препарат Биоспорин (рис. 8).

Бациллы в микроценозе

желудка и кишечника

Количественно умеренная

непродолжительная фиксация бацилл

на слизистой желудка

Участие в процессах

пищеварения (продукция

протеаз, амилаз, липаз,

целлюлаз и других ферментов

Антитоксическое

действие

Ингибирование патогенных

микроорганизмов (продукция

лизоцима, антибиотиков,

бактериоцинов, конкуренция с

патогенными бактериями)

Синтез

аминокислот

Ограниченная адаптация

вегетативных клеток в просвете

и частичная фиксация на

слизистой кишечника

Коррекция

нормоценоза и его

восстановление

Перманентная транслокация

бацилл в лимфоидные структуры

макроорганизма

Транслокация

бацилл

Активация

макрофагов

Деструкция патогенных

бактерий, контакт их антигенов

с иммунокомпетентными

клетками

Индукция

эндогенного

интерферона

Сорбция и выведение

тяжелых металлов

Усиление синтеза

иммуноглобулинов

Рис.8. Механизм лечебно-профилактического действия препарата Биоспорин.

(И.В. Тихонов, 2005)

Биоспорин применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника человека, вызванной нерациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесенными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций. Однако установлено, что спектр показаний для применения пробиотиков в клинической практике может быть существенно расширен. Так, выявлены их позитивные эффекты при лечении ревматоидного артрита, некоторых инфекций мочеполовых путей, гнойно-воспалительных осложнений в хирургической практике, гинеко­логических заболеваниях инфекционной природы и многих других.

Биод-5 - новый пробиотик ветеринарного назначения, разработанный сотрудниками кафедры биотехнологии МГАВМиБ имени Скрябина, включает два штамма бацилл - B.subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11.

Препарат предназначен для лечения животных, больных острыми кишечными инфекциями, вызванных сальмонеллами, шигеллами, стафилококками и другими патогенными микроорганизмами, для восстановления нормальной микрофлоры кишечника.

Технология предусматривает раздельное культивирование B.subtilis ТПИ 13 и В.licheniformis ТПИ 11 и смешивание их после стадии концентрирования в соотношении 3:1 (рис.9).

Приготовление питательной среды

Приготовление посевного материала

Процесс культивирования

Концентрирование микробной суспензии

Приготовление жидкой рецептурной массы

Высушивание

Приготовление готовой

лекарственной формы

Маркировка, упаковка и хранение препарата

Контроль

Рис.9. Схема технологического процесса производства Биод-5

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов с заданными свойствами, полученными методами генной инженерии. Первый такой пробиотик медицинского назначения Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов, характеризуется антивирусными свойствами. Этот препарат разработан в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины совместно с НПО «Вектор» (Россия) и в настоящее время проходит с успехом клинические испытания.

Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными заболеваниями человека и животных.