3.3. Источники питания

Элементы питания, необходимые для роста клеток, можно подразделить на следующие группы:

- источники основных элементов;

- источники элементов, требуемых в меньших количествах;

- аминокислоты;

- витамины и гормоны;

- источники микроэлементов.

Основные источники питания, функции в биосинтезе и их обеспечение для клеток приведены в табл.10.

Таблица 10.

Элементы питания клеток (И.В. Тихонов,2005)

Элемент	Источник их получения	Функция
1. Основные элементы питания
Н+	Кислота или щелочь	Интенсивность роста. Состав биомассы и морфологии
О2	Воздух, вода	Акцептор электронов или водорода (дыхание), катаболизм
С	Глюкоза, мальтоза, лактоза	Энергия роста, функция поддержания жизнедеятельности и построение клеток
N2	Неорганические и органические соединения, глутамат	Синтез белка, нуклеиновых кислот и полимеров клеточной стенки
2. Элементы питания, требуемые в меньшем количестве
Р	Неорганические фосфаты	Синтез белка, нуклеиновых кислот и полимеров клеточной стенки, катаболизм
К	Неорганические соединения	РНК, скорость роста
S	Сульфат, цистеин, метионин	Синтез аминокислот
Аминокислоты
Глутаминовая кислота, L – аминокислоты D - аминокислоты	Пептиды, гидролизаты, пептоны и т.п.	Фактор роста, синтез белка, клеточные стенки бактерий, ингибитор роста
Витамины и гормоны
Жирораствримые и водорастворимые витамины	Биотин, фолиевая кислота, пантотеновая кислота, тиамин, никотиновая кислота, никотинамид, пиридоксин, мезоинозит, холин	Фактор роста
Микроэлементы
Ca, Cu, Fe, Mg, Zn, Co, Mo	Соли, неорганические соединения	Интенсивность роста

При недостатке в субстрате каких-либо элементов в клетках могут включаться «запасные» механизмы биохимических процессов, направленные на выживаемость популяции.

Источники и методы получения вируссодержащего материала для изготовления противовирусных биопрепаратов.

Не так много времени прошло с тех пор, когда восприимчивые животные были единственным источником получения вируссодержащего сырья для изготовления биопрепаратов, что тормозило развитие исследований по совершенствованию технологии производства вакцин. В настоящее время в ветеринарной практике используют несколько вакцин, изготовленных из вирусного материала от животных (живая вакцина против африканской чумы лошадей, бешенства и некоторые другие). Значительных успехов производство вирусного сырья достигло после внедрения метода выращивания вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. В последние годы почти третья часть выпускаемых в мире вакцин готовится с использованием этих объектов. Однако наиболее перспективными и прогрессивными являются способы выращивания вирусов в культурах клеток.

Для получения культур клеток применяют:

• стационарный метод с использованием плоских сосудов (матрасы) или пробирок;

• роллерный — выращивание клеток во вращающихся бутылях;

• глубинный (реакторный) — культивирование клеток во взвешенном (суспензированном) состоянии в биологических реакторах;

• комбинированный способ с помощью роллерного и реакторного методов.

Живые противовирусные вакцины

Живые вакцины изготовляют из живых ослабленных (аттенуированных) штаммов вирусов. Такие штаммы должны обладать следующими стабильными, наследственно закрепленными свойствами:

- утрата вирулентности исходного вируса;

- сохранение способности приживаться и размножаться в организме;

- сохранение специфической иммуногенности исходного патогенного штамма;

- способность вызывать образование иммунитета у привитых животных.

Введенные в организм вакцинные штаммы должны вызывать не заболевание, а особое, качественно новое состояние — так называемый вакцинальный процесс.

Получение вакцинных штаммов с перечисленными свойствами удается путем культивирования вирулентных вирусов (обычно выделенных от больных животных в очаге инфекции) в условиях, не соответствующих их природным потребностям адаптирования к маловосприимчивым или невосприимчивым животным, а также выращивания в развивающихся куриных эмбрионах или в культуре клеток. При многократном пассировании на живых системах вирусы постепенно теряют патогенность, сохраняя антигенные свойства.

К перспективным методам получения вакцинных штаммов следует отнести селекцию природно-ослабленных штаммов вирусов при атипично или латентно протекающих инфекциях, а также селекцию мутантов, индуцированных физическими и химическими мутагенами (пониженная температура культивирования, ультрафиолетовое облучение, воздействие ультразвуком и др.).

Для приготовления живых вакцин используют также гетеротипичные антигенно-родственные апатогенные штаммы: штаммы вируса оспы голубей для профилактики оспы кур, вирус кори для защиты собак от чумы плотоядных, вакцинный штамм вируса чумы свиней для профилактики диареи крупного рогатого скота и др.

Технология изготовления живых вакцин сводится к культивированию вакцинного штамма вируса в какой-либо биологической живой системе (животные, куриные эмбрионы, культуры тканей и клеток). Полученный вируссодержащий материал подвергают очистке от балластных (клеточных компонентов и др.) веществ. Далее проводят контроль на чистоту (посев на бактериальные питательные среды), безвредность и активность на восприимчивых животных. При соответствии этим требованиям полученный материал разливают по ампулам или флаконам и подвергают лиофильному высушиванию.

Живые вакцины, полученные на основе аттенуированных вакцинных штаммов вирусов, обладают рядом преимуществ перед инактивированными. Главное из них — напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближающегося к постинфекционному. Важное достоинство большинства живых вакцин — однократное введение. При этом происходит репродукция вакцинного штамма в организме в результате образования и поступления в организм в течение длительного времени активных антигенных субстанций, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета. Вторым преимуществом живых вакцин является возможность вводить их не только подкожно, но и перорально, интраназально и аэрозольно.

Однако живые вакцины наряду с отмеченными преимуществами имеют и ряд недостатков, связанных с тем, что действующее начало этих препаратов (живых вирусов) весьма чувствительно к неблагоприятным факторам, возникающим в производстве, при транспортировке, хранении и применении, а также не исключена возможность реверсии вируса.

В специальных требованиях предусматривается качество компонентов живых вакцин и особенно чистота вируссодержащего материала. При получении живых вакцин на культурах клеток, в куриных эмбрионах субстраты могут оказаться контаминированными посторонними вирусами, микоплазмами, бактериями, и это может привести к серьезным последствиям.

Живые вакцины не содержат консервантов, поэтому при вскрытии ампул и растворении их содержимого необходимо строго соблюдать правила асептики. При накожном методе вакцинации необходимо использование для предварительной обработки таких дезинфицирующих средств, которые длительное время сохраняются на месте применения препарата.

Инактивированные противовирусные вакцины

Штаммы, предназначенные для изготовления инактивированных (убитых) вакцин, представляют собой культуру типичного представителя данного вида вируса и по биологическим свойствам должны быть идентичны циркулирующим в природе эпизоотическим штаммам и высоковирулентны.

Изготовление инактивированных вакцин также начинается с культивирования и накопления производственного штамма вируса в чувствительной биологической живой системе (животные, развивающиеся куриные эмбрионы, культуры клеток и тканей). Полученный вируссодержащий материал гомогенизируют и подвергают очистке. Очистка при получении инактивированных (убитых) вакцин является важным этапом, так как убитый вирус не репродуцируется в организме и для получения достаточно интенсивного иммунного ответа необходимо вводить при вакцинации значительное количество вируссодержащего материала. Суспензия вируса, используемая для изготовления вакцин, обычно содержит значительные количества компонентов клеток, которые оказывают дополнительную нагрузку на иммунную систему организма, поэтому вирусные суспензии должны быть очищены от балластных агентов (обычно используют низкоскоростное центрифугирование).

Далее основное требование, предъявляемое к убитым вакцинам, — полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности антигенной детерминанты (цепей полипептидов, вызывающих образование специфических антител) и иммунная защита животных. Поэтому инактивант должен необратимо повреждать нуклеиновую кислоту и в минимальной степени затрагивать белки. При абсолютной инактивации вируса должны быть такие изменения генома, которые исключают транскрипцию или трансляцию вирусной РНК или репликацию вирусной нуклеиновой кислоты.

Для получения инактивированных вакцин в качестве инактиванта широко используют формалин, гидроксиламин, этанол, (3-пропиолактон, этиленимин, УФ- и гамма-излучения, воздействие температуры, а также другие инактивирующие инфекционность факторы. Все реагенты, которые используют для инактивации вирусов, должны активно реагировать с компонентами нуклеиновых кислот, т. е. являться сильными мутагенами. Поэтому избыток инактиванта по окончании реакции должен быть полностью удален или переведен в неактивную форму. Для повышения иммуногенной активности к инактивированной вирусной суспензии (вакцине) добавляют адъюванты: гидроокись алюминия, сапонин, минеральное масло и др. Для консервации вакцины используют глицерин, фенол, мертиолят и др.

На конечном этапе перед выпуском вакцину проверяют на наличие остаточной вирулентности (на восприимчивых и лабораторных животных, в культуре клеток), на стерильность (на бактериальных питательных средах, лабораторных животных), на иммуногенную активность (на восприимчивых животных). Вакцины, не прошедшие контроль по одному из указанных тестов, бракуют.

Инактивированные-вакцины обладают высокой безопасностью, стабильными свойствами, возможно их применение в поливалентном варианте.

У инактивированных вакцин имеются следующие недостатки:

• слабая иммуногенность, иммунитет менее напряженный и длительный, чем при использовании живых вакцин;

• способность иногда вызывать аллергическое состояние у животных послеповторной иммунизации;

• сложный процесс технологии изготовления; неполная гарантия, безопасности препарата.

Субъединичные и генно-инженерные вакцины

Субъединичные вакцины. Для создания субъединичных вакцин используют три метода.

Первый метод — получение большого количества вирусов, очистка и выделение иммуногенных субъединиц; это так называемые сплит-вакцины. Однако этот способ является дорогостоящим, и он вряд ли найдет когда-либо промышленное применение.

Второй метод — химический синтез специфического иммуногена. При его использовании необходимо знание структуры и аминокислотного состава антигенных детерминант. Детерминантные участки, которые включают в себя только несколько аминокислот, могут быть синтезированы химически и соединены с белком-носителем, таким, как бычий сывороточный альбумин; затем сцепленный белок используют в качестве вакцины. К сожалению, это требует технологически сложного пептидного синтеза.

Третий метод — рекомбинантный.

Генно-инженерные вакцины. Рекомбинантные вакцины получают с помощью биотехнологии. Их изготовление — новое направление в создании генно-инженерных противовирусных вакцин, суть которого состоит во введении в геном крупных вирусов генов протективных белков (противовирусных). В качестве продуцента протективного антигена вируса наиболее часто используют кишечную палочку. В плазмиду кишечной палочки «встраивают» ген вируса, ответственный за синтез протективного антигена. Полученную кишечную палочку культивируют в реакторах, которые синтезируют полипептид вируса. Из бактериальной культуры полипептид вируса выделяют методом молекулярной биологии.

Субъединичные вакцины обладают значительными преимуществами по сравнению с традиционными препаратами: они безопасны, так как не содержат вируса, способного вызвать заражение, свободны от вредных примесей, стабильны и не требуют хранения в рефрижераторах. Однако сегодня их главный недостаток - слабые иммуногенные свойства. Для этой цели ведется поиск новых адъювантов и иммуностимуляторов.