Тема 4. Генная инженерия в биотехнологии

Методы генной инженерии

К началу 70-х годов прошлого столетия были изучены основные генетические системы. Была сформулирована так называемая «центральная догма», согласно которой генетическая информация передается от ДНК к РНК и далее к белку, что создало основу для определения генотипа и фенотипа организма на молекулярном уровне. Был идентифицирован основной посредник при переносе информации от ДНК к белку - мРНК (матричная или информационная РНК), расшифрован генетический код и получена информация об основных механизмах трансляции мРНК в белок. Расшифровка генетического кода позволила также разрешить вопрос о природе мутации. Кроме того, были получены первые сведения о регуляции процессов транскрипции и трансляции в различных клетках.

Одновременно с этими выдающимися открытиями было идентифицировано несколько классов ферментов, субстратами которых являются молекулы ДНК и РНК, что в значительной мере облегчило анализ структуры и функций нуклеиновых кислот, а применение их дальнейших исследованиях привело к созданию новой области биотехнологии – технологии рекомбинантных ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала из одного организма в другой. Организмы, полученные при помощи генно-инженерных манипуляций, называют трансгенными или генетически модифицированными.

Генную инженерию можно также определить как конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или как создание искусственных генетических программ.

Прикладная генная инженерия имеет задачу конструировать рекомбинантные ДНК, которые могли бы придать клеткам-реципиентам полезные для человека свойства, например, способность синтезировать вещества, необходимые для медицины и ветеринарии (диагностические препараты, вакцины, гормоны, инсулин, соматотропин, иммунокорригирующие вещества, интерферон, белки крови, урокиназу, α-антитрипсин, гаптоглобин и др.), синтезировать пищевой и кормовой белок, утилизировать ксенобиотики (пестициды, гербициды и др.).

Историю развития генной инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами и фагами, иначе говоря, конструированием так называемых векторных молекул.

На этом этапе были доказаны:

а) возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК от различных видов и штаммов бактерий;

б) их жизнеспособность;

в) стабильность;

г) функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинатных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап связан с началом работ по включению в векторные молекулы ДНК генов эукариот, главным образом, растений и животных.

Формально датой рождения генной инженерии следует считать 1972 г., когда Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, состоявшую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага λ dygal с галактозным опероном Е. coli.

Инструментами молекулярного манипулирования стали прежде всего, два типа ферментов - рестриктирующие эндонуклеазы и лигазы. Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые - для их соединения.

Первая рестриктаза была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем, а наиболее широко применяемая в настоящее время рестриктаза EcoRl получена в 1971 г. Простые методы электрофоретического разделения в гелях позволяют рассортировать смесь фрагментов ДНК, образованных действием рестриктазы, по их длине и таким образом получить химически однородный материал.

Ферменты, которые в настоящее время применяются для конструирования рекомбинантных ДНК, можно разделить на следующие группы:

Ферменты, осуществляющие фрагментацию ДНК. К этой группе относятся рестриктирующие эндонуклеазы: ферменты, узнающие и расщепляющие определенные последовательности в ДНК. Для каждого конкретного фермента эти последовательности отличаются по длине и первичной структуре. Список рестриктаз постоянно расширяется, известно более 85 участков последовательностей, узнаваемых рестриктазами.

Фермент, синтезирующий фрагменты ДНК на матрице РНК: РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза).

Ферменты, сшивающие фрагменты ДНК: ДНК-лигаза (полинуклеотидлигаза) бактериофага Т4 и ДНК-лигаза Е. coli.

Ферменты, позволяющие осуществлять изменение структуры концов фрагментов ДНК: нуклеаза Bal 31 из Alteromonas espejiana, кзонуклеаза III E.coli, нуклеаза S, из Aspergillus oryzae, нуклеаза из манговых бобов, щелочная фосфатаза E.coli из кишечника теленка, полинуклеотидилтрансфераза из тимуса теленка, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, ДНК-полимераза фага Т4.

Ферменты, применяемые для приготовления гибридизационных проб: ДНК-полимераза I E.coli, ДНК-полимераза фага Т4.

Важное значение имеют успехи химии нуклеиновых кислот и, прежде всего, секвенирование ДНК, т.е. определение последовательности нуклеотидов и ее молекулах. Одно только применение рестриктаз позволяет; получить ориентировочные физические карты молекул ДНК, но секвенирование даёт исследователю структуру с предельным разрешением в один нуклеотид. А именно это необходимо для современного уровня молекулярного генетического конструирования.

Методы секвенирования, разработанные Сэнгером и Максэмом-Гилбертом, стали обязательным элементом генной инженерии.

Накопление аналитических данных по строению генома идет так стремительно, что требует использования ЭВМ. Впрочем, последние необходимы не только для накопления банка данных, но также как инструмент исследования способа записи в геноме регуляторных сигналов.

Следующий вклад химии нуклеиновых кислот в генную инженерию — это способы химического и химико-энзиматического синтеза дезоксиполинуклеотидов. Основы этого синтеза были созданы еще Г.Кораной, когда он в 1979 г. синтезировал 207-звенный дезоксиполинуклеотид - ген тирозиновой супрессорной РНК. Т.к. большинство генов эукариот имеют мозаичную структуру, то в данный момент они не могут быть прямым образом использованы, кроме того, способы химического синтеза становятся все более эффективными.

Основным объектом манипуляций генной инженерии служат гены, т.е. фрагменты ДНК, являющиеся функциональной единицей наследственности, кодирующей (как правило) определенный белок.

С молекулярной точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, транскрибируемую в РНК.

Подавляющее большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют так называемые структурные гены, на которых синтезируется мРНК. Остальные кодирующие последовательности приходятся на долю тРНК (транспортной) и рРНК (рибосомальной).

У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. Транскрипция начинается со связывания РНК-полимеразы с промотором, и далее последовательно копируется весь структурный ген с образованием функциональной мРНК.

В бактериальном геноме гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине молекулы ДНК, а в некоторых случаях даже перекрываются. Гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, или ферменты, активности которых так или иначе связаны между собой, часто образуют опероны. Обычно оперон находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется единственная молекула мРНК, кодирующая несколько белков. При транслации такой мРНК, в которой стоп-кодов предыдущего гена соседствует со старт-кодоном последующего, синтезируется набор отдельных белков.

Белок-кодирующие последовательности ДНК у эукариот прерываются некодирующими участками ДНК (рис.2.1б). Некодирующие сегменты называются интронами, а кодирующие участки генов – экзонами. После завершения транскрипции интроны удаляются из первичного транскрипта, а экзоны сшиваются друг с другом.Этот процесс получил название сплайсинга.

Эукариотические мРНК содержат на своем 3 конце «хвост» из 100-200 последовательно присоединенных остатков аденозина так называемый, роlуA-хвост. Кроме того, на 5 конце молекулы мРНК присутствует «кэп», представляющий собой остаток 7-метилгуанозина, присоединенный при помощи необычной трифосфатной связи. У прокариотических мРНК данные элементы отсутствуют.

Гены получают одним из трех способов: непосредственным выделением из природного источника, получением дезоксиполинуклеотидных реплик (кДНК) путем копирования мРНК и химическим синтезом.

Ген в большинстве случаев содержит только последовательность, необходимую для синтеза полипептидной цепи, но не имеет системы сигналов, управляющей его действием в клетке. Так что систему исследователь создает в виде вектора - циклической дезоксиполинуклеотидной молекулы, содержащей сигналы репликации и транскрипции. Сочетание генов и векторов дает рекомбинантную молекулу ДНК.

Векторы - предмет особенного внимания исследователей; их создано множество, с учетом целого ряда специальных требований.

Однако, если операции с ДНК in vitro не подвержены видовым ограничениям, то in vivo, при репликации и транскрипции рекомбинантных ДНК, эти ограничения действуют. И поэтому свойства вектора необходимо подгонять к особенностям клетки, в которую введена рекомбинантная молекула ДНК.

Вектор содержит генетические маркеры, по которым ведут селекцию генетически модифицированных клеток. Чаще всего в прокариотеческих системах - это гены устойчивости к антибиотикам (ампициллину, тетрациклину и др.).

Особенно успешными можно считать исследования по клонированию рекомбинантных ДНК в клетках хорошо изученных организмов. Наряду с E.coli, это B.subtilis. Разработаны методы клонирования в S. cerevisiae, сконструированы челночные векторы, содержащие дрожжевой селективный маркер.

Клетка-хозяин пока единственная среда, в которой может функционировать рекомбинантная молекула ДНК как искусственная генетическая программа.

После введения в реципиентную клетку рекомбинантные ДНК становятся составной частью ее генетического аппарата и придают ей новые генетические и, следовательно, физиологические и биохимические свойства.

Процесс конструирования рекомбинантных ДНК предполагает существование следующих представлений и методических приемов:

четких представлений о молекулярных структурах и механизмах функционирования генов, подлежащих клонированию;

способов выделения этих генов из живых объектов или их химического синтеза;

методических возможностей сшить нужные гены в определенной последовательности с выполнением правил, обеспечивающих эффективную экспрессию (транскрипцию и трансляцию);

методов введения рекомбинантных ДНК в реципиентный организм и создания таких условий, при которых рекомбинантная ДНК стабильно сохранялась бы и функционировала в организме продолжительное время.

Процесс переноса генов проводится по следующей схеме и включает пять основных этапов:

1. Получение фрагментов ДНК (генов).

2. Создание рекомбинантной генетической конструкции. На этом этапе производится встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор). Для выделения, анализа и конструирования генов используют клетки прокариот.

3. Введение ДНК в клетку-хозяина. Получившуюся молекулу рекомбинантной ДНК вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется (размножается) либо самостоятельно, либо интегрируется в хромосому и передается потомкам.

4. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Производится на селективной среде, на которой могут вырасти только трансформированные клетки.

5. Анализ экспрессии (встраивания) перенесенного гена в ДНК клетку-хозяина. Получение специфического белкового продукта, синтезирующегося клетками-хозяевами, служит подтверждением их трансгенной природы.

С момента введения рекомбинантной ДНК в клетку начинается молекулярное клонирование, т.е. получение потомков созданной рекомбинантной ДНК.

Ни один метод перенесения ДНК в клетку не может обеспечить 100% попадания. Часть клеток оказывается трансформированными, часть получает вектор без вставки. Для первичного отбора трансформированных клеток применяют различные селективные гены, детерминирующие какие-либо отличительные фенотипические особенности: возможность детоксикации антибиотика, утилизации определенного субстрата или роста на обедненных средах. По возможности роста на селективной среде производится отбор клеток, получивших векторную ДНК. Далее проводится отделение нужных клонов (клон-группа генетически однородных клеток, образовавшихся в результате деления одной клетки). Анализ может базироваться на определении самого перенесенного гена, либо быть связанным с его функцией (продуктом экспрессии гена).

Основные методы анализа генетически модифицированных организмов приведены в табл.5.

Таблица 5.

Методы и принципы анализа трансформированных клеток и трансгенных организмов (И.В. Тихонов, 2005)

Метод	Основные принципы
1	2
1	2
Фенотипиче- ский отбор	Анализ основан на использовании специфических свойств, проявляемых нужным клоном. К ним относятся морфологи- ческие изменения трансформированных клеток (например, характера их роста) или синтез определенных соединений, которые можно идентифицировать при помощи стандартных биохимических методов
Иммунохимиче -ский анализ	Для проведения идентификации белка, кодируемого перене- сенным геном, используют специфические антитела. Детек- тирование связывания антител с нужным белком проводят при помощи вторичных антител, специфичных в отношении первых, меченых ферментом или радиоактивной меткой
Полимеразная цепная реакция	Проводят амплификацию последовательности перенесенного гена при помощи специфических праймеров. Идентифика- цию ПЦР-продуктов проводят при помощи гельэлектрофореза
Гибридизация	Изолируют тотальную ДНК, обрабатывают рестриктазами и фракционируют при помощи гель-электрофореза. Денатури- руют ДНК в геле и переносят на нейлоновую мембрану. Мембрану инкубируют с денатурированным (или одноцепо- чечным) радиоактивным фрагментом (зондом), гомологич- ным перенесенному гену. Отожженный зонд детектируют при помощи радиоавтографа. Аналогично проводят гибри- дизацию ДНК-зонда с тотальной мРНК, выделенной из трансформированных клеток

Очень эффективным при получении рекомбинантных клеток в ряде случаев оказывается метод слияния протопластов. Этот метод применим как для микробных, так и для растительных клеток. Известно несколько способов разрушения оболочек бактериальных клеток при помощи фермента лизоцима, дрожжевых клеток - при помощи ферментов желудочного сока улиток или комплексов микробных ферментов (дрожжелитина). После слияния протопластов образуются гибридные клетки, в которых возможна рекомбинация генов.

Рекомбинантные микроорганизмы

Рекомбинантные штаммы бактерий и дрожжей широко используют для микробиологического синтеза белков, витаминов, аминокислот, антибиотиков и других ценных соединений.

Методами генной инженерии можно усиливать природную способность определенных видов бактерий к осуществлению специфических биологических процессов и создавать высокоэффективные штаммы микроорганизмов, осуществляющие разрушение токсичных субстратов или способствующие росту культурных растений.

Большой интерес представляет производство в клетках микроорганизмов белков терапевтического назначения. С этой целью кДНК, несущую информацию о структуре нужного белка, клонируют в экспрессирующем прокариотическом векторе, что позволяет достичь высокого уровня экспрессии. Рекомбинантные бактерии выращивают на специальных питательных средах, позволяющих отличить их от «диких» штаммов по изменению фенотипических свойств (изменению морфологию колоний) или угнетающих рост нерекомбинантных клеток.

Некоторые примеры использования рекомбинантных микроорганизмов и продуктов микробного синтеза представлены в табл.6.

Таблица 6.

Область применения рекомбинантных микроорганизмов

Область применения	Примеры
Медицина и Ветеринария	Производство инсулина, интерлейкинов, интерферона, гормона роста, эритропоэтина, ДНК-азы, альгинат- лиазы, иммуноглобулинов, рекомбинантных вакцин
Сельское хозяйство	Микробные инсектициды, микробные удобрения, про- изводство стимуляторов роста растений
Биодеградация	Утилизация целлюлозы, ароматических соединений, производство этанола
Производство фермен- тов и малых биомоле- кул	Эндонуклеазы рестрикции и др. ферменты для иссле- довательских нужд, химозин, аминокислоты (лизин, триптофан и др.), индиго, L- аскорбиновая кислота, ан- тибиотики.

Прикладное значение генной инженерии для ветеринарной науки и практики заключается в создании, в первую очередь, вакцинных препаратов на основе генетически модифицированных штаммов микроорганизмов.

Получение рекомбинантных вакцин включает в себя несколько этапов:

- клонирование генов, обеспечивающих синтез необходимых антигенов;

- введение клонированных генов в вектор (вирусы, плазмиды);

- введение векторов в клетки-продуценты (бактерии, грибы);

- культивирование клеток in vitro.

- выделение антигена и его очистки или применение клеток-продуцентов

в качестве вакцин.

В последние 5 лет создано новое направление в разработке генно-инженерных вакцин, основанное на введении плазмидной ДНК (вектора) с встроенным геном протективного белка непосредственно в организм животного.

Иммунизацию плазмидной ДНК с чужеродным геном называют ДНК-вакцинацией (генетической иммунизацией, вакцинацией нуклеиновыми кислотами, вакцинацией «голой» ДНК).

Новый подход дает возможность на базе одного плазмидного вектора конструировать различные ДНК-вакцины. Меняют только ген, кодирующий протективный белок. ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых.

К настоящему времени сконструированы ДНК-вакцины против ряда вирусных, бактериальных и паразитарных болезней.

Достоинство ДНК-вакцин:

1. При разработке таких вакцин можно достаточно быстро получить рекомбинантную плазмиду, несущую себе ген, кодирующий необходимый белок патогена, в отличие от длительного процесса получения аттенуированных штаммов возбудителей.

2. Технологичность и низкая себестоимость культивирования полученных плазмид в клетках E. Coli и ее дальнейшей очистки.

3. Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет кон-формацию, максимально близкую к нативной, и обладает высокой антигенной активностью, что не всегда достигается при использовании субъединичных вакцин.

4. Элиминация векторной плазмиды в организме вакцинированного животного происходит за короткий промежуток времени.

5. При ДНК-вакцинации против особо опасных инфекций вероятность заболевания животного в результате иммунизации полностью отсутствует.

6. Возможен пролангированный иммунитет.

Все вышеуказанное позволяет называть ДНК- вакцины вакцинами XXI века.

Однако, несмотря на то, что эффективность иммунизации ДНК-вакцинами очевидна, потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике инфекционных болезней животных.

Трансгенные животные

Эксперименты по генетической модификации животных требуют значительных затрат времени. Тем не менее, трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека.

Введение чужеродной ДНК в животные клетки можно осуществить либо физическими методами (микроинъекция, электропорация, слияние липосом), либо при помощи вирусных векторов.

Для изучения экспрессии перенесенных генов в лабораторных условиях используют животные клетки, выращенные в культуре перевиваемых клеточных линий. Такие линии, полученные из эмбрионов грызунов, почек и опухолей обезьян и человека, широко используются в экспериментах с рекомбинантной ДНК.

Стратегия получения трансгенных животных состоит в следующем:

1. Клонированный ген в составе вектора вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.

2. Инкубированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь.

3. Отбирают потомков, которые содержат клонированный ген во всех клетках.

4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Далее представлены основные схемы получения трансгенных животных.

1. Вектором на основе ретровируса животных инфицируют 8-ми клеточный эмбрион, который потом имплантируется в самку. Этот способ трансформации считается наиболее эффективным.

2. Трансгенную конструкцию вводят путем микроинъекции в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки, которая затем переносится в «суррогатную мать».

3. Стволовые клетки модифицируются в культуре, после чего их вводят в эмбрион на стадии бластоцисты.

4. Перенос гена осуществляют при помощи дрожжевых хромосом (YАС), что позволяет переносить несколько генов вместе с их собственными регуляторными последовательностями.

Схема получения трансгенных животных путем микроинъекции ДНК представлена на рис. 2.

Приготовление раствора ДНК

для микроинъекций

Подготовка доноров и

извлечение эмбрионов

Визуализация пронуклеусов в эмбрионах животных

и микроинъекция ДНК

Пересадка инъекцированных эмбрионов в яйцеводы

Или (после промежуточного культивирования) в

матку синхронизированных реципиентов

Доказательство интеграции у родившихся потомков и

исследование экспрессии трансгена на уровне

транскрипции (иРНК) и трансляции (протеин)

Получение трансгенных

потомков

Рис.2. Схема получения трансгенных животных

Кроме создания новых пород крупного рогатого скота с улучшенными ростовыми характеристиками и повышенной устойчивостью к болезням, можно использовать животных в качестве «биофабрик» для получения терапевтически важных белков, секретируемых в молоко. К числу таких белков относятся лактоферрин, интерлейкины, урокиназа и др.

Сегодня с генной инженерией связывают возможность решения многих насущных вопросов:

- возможность точной диагностики и лечения многих заболеваний;

- повышение урожайности сельскохозяйственных культур путем создания растений, устойчивых к неблагоприятным факторам среды и вредителям;

- создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения и лекарственные препараты;

- создание пород животных с улучшенными признаками;

- переработка отходов.

Повышение эффективности биотехнологии

методами генной инженерии

Современные методы генной инженерии позволили получить сверхпродуценты, в которых продукт клонированного гена составляет 10 - 50 % растворимых белков. Важнейшими факторами, которые следует принимать во внимание при получении сверхпродуктов, являются вид микроорганизма-хозяина, стабильность рекомбинантной плазмиды, сила промотора, использование кодонов в мРНК, посттрансляционная модификация и локализация белка.

Основным способом увеличения выхода целевого продукта является способ увеличения количества копий гена (амплификация) в клетке введением нужного гена в многокопийные плазмиды. Этот подход используют как для собственных эндогенных генов клетки-хозяина, так и для генов, внесенных из другого организма.

Сверхпродуцент треонина получен путем амплификации генов, ответственных за синтез ферментов анаболизма треонина. Для этого использовано клонирование этих генов на одной из плазмид E.coli, представленной в клетке в количестве 40 - 50 копий. Ряд регуляторных мутаций, введенных в геном реципиентного штамма E.coli и в клонируемый оперон, позволили создать штамм, биосинтетическая активность которого более чем в 10 раз превосходит продуктивность исходного. Подобным образом сконструированы сверхпродуценты нескольких рестриктаз и ДНК-лигазы E.coli.

Для E.coli с успехом используются сильные промоторы lac, trp, tac и термоиндуцибельный промотор P_L фага лямбда. Для B.subtilis известны три сильных промотора Pen P, AI фага Ф29 и а-амилазы.

Важной задачей генной инженерии является расширение спектра субстратов, используемых промышленными микроорганизмами и микроорганизмами-очистителями окружающей среды. Так, с целью создания штаммов-продуцентов микробного белка, способных расти на таких дешевых субстратах, как молочная сыворотка и целлюлозосодержащие отходы, проводится клонирование в S.cerevisiae генов, кодирующих синтез Р-галактозидазы и ксилозоизомеразы.

Для пищевой промышленности важной задачей, в частности, является получение штаммов дрожжей, способных к непосредственному сбраживанию крахмала и целлюлозы, а также создание продуцентов пиранозооксидазы, участвующей в изомеризации глюкозы во фруктозу.

Проводятся работы по клонированию в S.cerevisae экзо- 1,4- D- изоксидазы Aspergillus awamori, экзоцеллюлобиогидролазы Trichoderma reesei ипиранозооксидазы Polyporus obtusius.

Путем расширения спектра используемых микроорганизмами субстратов достигается более эффективное предохранение окружающей среды от загрязнения. Так, с помощью переноса природных или конструированных плазмид созданы штаммы псевдомонад, способные утилизировать углеводы нефти, штаммы дрожжей, устойчивые к синтетическим органическим гербицидам, и др. различные штаммы микроорганизмов, эффективно разлагающие ксенобиотики.

Методами генетической инженерии также можно повысить эффективность использования субстрата и улучшить качество целевого продукта. Например, замена тратящей много энергии системы ассимиляции азота у Methylophylus methylotropus на более экономичную систему из E. Coli.

Методы генной инженерии могут быть использованы для повышения продуктивности биосинтеза путем увеличения устойчивости продуцентов к собственному целевому продукту. Например, биосинтез аминогликозидных антибиотиков может быть увеличен введением в геном стрептомицета генов, которые кодируют синтез трансформирующих аминогликозид ферментов.

Получение новых препаратов методами генной

инженерии

Многие протеины высших эукариотов содержатся в естественных источниках в небольших, часто следовых количествах. Методами генной инженерии можно внести соответствующие гены в микроорганизмы и получить экспрессию этих генов.

По литературным данным, в E. Coli. получена экспрессия около 70 протеинов высших эукариотов, таких как: соматостатин, инсулин, энцефалин, протеинкиназа вируса саркомы Рауса, гормон роста человека, интерферон фибробластов человека, лейкоцитарный интерферон, антиген вируса гепатита В, вирус ящура, химозин, гормон роста быка.

Наглядно успехи генной инженерии в биотехнологии иллюстрирует пример с интерферонами. В настоящее время можно изготовить любое количество интерферона, которое потребуется для практики. Применение генной инженерии дало значительный эффект – из 1 л культуры тканей получают 10⁸ ед. интерферона, в то время как 1л культуры E. Coli обычно дает 10¹⁰ ед. «рекомбинантного интерферона».

В настоящее время ряд фирм налаживают производство интерферона из рекомбинантных дрожжей. Дрожжи имеют два главных преимущества по сравнению с E. Coli: наличие секреторных систем, благодаря которым можно получить внеклеточный интерферон, и отсутствие токсичных веществ, которые имеются у E. Coli.

Одним из практически важных белков для медицины, получение которого целесообразно проводить микробиологическим путем, является инсулин человека. Инсулин в настоящее время является первым продуктом бактерий, преобразованных генно-инженерными методами, поступившими в продажу для использования во врачебной практике.

Задачей отдаленного будущего является конструирование новых генов и получение новых, пока неизвестных полезных белков. Это будет возможно после подробного фундаментального изучения взаимосвязи между строением белковой молекулы и ее функциями.

По мнению многих исследователей, нельзя отождествлять биотехнологию с рекомбинантной техникой и создавать миф о том, что при помощи методов генной инженерии в будущем будут решены все проблемы биотехнологии. Генная инженерия является способом создания биологических агентов. Над получением рекомбинантных биологических агентов, как правило, работают множество высококвалифицированных исследователей. Методы генной инженерии не имеют стандартных решений, поэтому ключевое значение в таких разработках имеют люди – их талант, интуиция, работоспособность.

Крупномасштабное производство с использованием рекомбинантных продуцентов осложняется и несколькими причинами биологического характера. Основные из них:

- генетическая нестабильность внехромосомных элементов – рекомбинантные плазмиды легко элиминируются из клеток. Клетка находится в постоянном метаболическом стрессе, так как продуцируют значительное количество однородного протеина и обладают пониженной скоростью роста, по сравнению с клетками дикого типа;

- недостаточная изученность генетики промышленных микроорганизмов. Множество рекомбинантных продуцентов разработано на базе бактерий E. Coli., которые накапливают продукты внутриклеточно, менее изучены бациллы и дрожжи. Генетика таких перспективных промышленных микроорганизмов, как коринебактерии, облигенные анаэробы и экстремальные термофилы, не изучена;

- недостаточная толерантность продуцента к высоким концентрациям целевого продукта. Особенно это относится к продуцентам этанола, бутанола, органических кислот.

Несмотря на указанные трудности, методы генной инженерии все прочнее занимают свое место в создании новых и улучшении существующих

биологических препаратов.