Тема 8. Культивирование вирусов в культурах клеток и тканей

Значительным вкладом в развитие вирусологии явилось применение тканевых клеточных культур, что существенно продвинуло вперед вирусологические исследования. Этому в огромной степени способствовало открытие антибиотиков, создание синтетических и полусинтетических питательных сред.

Широкое применение клеточных культур при производстве вирусных биопрепаратов началось в 1950 - 57 гг. Этот период известный в мире вирусолог Бернет назвал «второй золотой эпохой» развития вирусологии.

По сравнению с другими методами накопления вирусов, способ культур тканевых клеток является относительно дешевым и, благодаря этому, он может быть использован для культивирования практически всех известных вирусов. На культурах клеток можно получить достаточно «чистый» вирус, с небольшим числом чужеродных антигенов в виде клеточных компонентов, что очень важно при изготовлении противовирусных вакцин, сывороток и диагностикумов.

В настоящее время на биопредприятиях России клеточные культуры используют при производстве более 40 вирусных вакцин, обеспечивающих надежную профилактику вирусных инфекций у животных. В необходимых случаях на основе культур клеток производят иммуноферментные и другие высокочувствительные диагностикумы для установления вирусных инфекций. Изготовление указанных препаратов требует высокой технологии производства, создания банков культур и вирусов.

В современном производстве вирусных вакцин культуры клеток являются основной системой для репродукции вирусов. Это идеальная, относительно однородная популяция клеток, которая при использовании разных возможностей размножения антигена представляет наилучшие предпосылки для количественно неограниченного, качественного, высокоценного, поддающегося стандартизации и достаточно надежно контролируемого производства вакцин. В производстве вакцин используют культуры клеток, к которым, согласно рекомендациям ВОЗ, предъявляют следующие требования:

1. Клетки должны происходить из нормальных тканей, причем предпочтение отдается тканям плода в силу меньшей вероятности их контаминации.

2. Во время культивирования клетки не должны значительно отклоняться от нормального кариотипа.

3. В период активного роста клетки не должны обнаруживать никаких морфологических аномалий.

4. Клетки должны быть свободны от всех выявляемых контаминантов.

5. Клетки не должны вызывать опухолей у хомячков после инокуляции в защечный мешок.

Получение культур клеток и их классификация

Следует иметь в виду, что при выращивании культур клеток необходимо исключить их контаминацию бактериями, грибами и вирусами. Для этого при работе с ними нужно соблюдать строжайшую стерильность, а от вирусной контаминации избавляются путем использования SPF доноров.

Культуры клеток из тех или иных тканей или органов получить несложно. Но эта технология требует скрупулезности, осторожности, определенных приемов и навыков. Клетки из тканей высвобождают путем размельчения и воздействием трипсина, папаина, коллагеназы, эластазы, муказы и т.д. Но наиболее пригоден для получения культур клеток очищенный трипсин. В размельченную ткань помещают очень слабо концентрированный (0,25 %) трипсин, который разрушает межклеточное вещество, что способствует разделению клеток. Применяя электромагнитную мешалку, центрифугу и многократно промывая клеточную суспензию, получают маточную основу живых клеток, которую помещают в соответствующую питательную среду. Затем выращивают культуру клеток в термостате при температуре 37°С и через 3-4 сут получают готовую культуру клеток. Наличие роста клеточной культуры определяют под микроскопом. Нормально растущая культура клеток под микроскопом будет представлять один слой клеток, вплотную прилегающих одна к другой, и имеющих типичную для данной культуры морфологию. При изменении температуры, рН среды рост клеток замедляется культура клеток может погибнуть.

Для получения культуры клеток применяются так называемые ростовые среды, содержащие белок сыворотки крови определенных животных, гидролизаты лактоальбумина и т.д.

Время генерации различных культур клеток составляет 15-50 ч. По достижении определенного, хорошего роста, дальнейшее их размножение прекращают. Такая культура клеток может использоваться для выращивания в ней вирусов (рис. 2).

Т кань плода или взрослой особи

Н ормальная ткань

Неопластическая ткань

П ервичная культура

П ервичная субкультура

Н ормальная диплоидная

Гетероплоидная клеточная

Т рансформация

Строение и гибель

Постоянные (перевиваемые) линии

Рис. 2. Получение клеточных линий при культивировании in vitro

соматических клеток (по Гриффитсу Дж. Б., 1989)

Приведем конкретный пример получения клеточной культуры из почек телят (ПТ), применяемой выращивания вакцинного авирулентного штамма ТК-А (ВИЭВ) вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Для получения культуры клеток ПТ используют почки от теленка в возрасте 1-1,5 месяца. С почек снимают капсулу, измельчают почечную ткань до кусочков величиной 3-5 мм, тщательно промывают раствором Хенкса с антибиотиками. Измельченную ткань переносят в стерильную колбу и заливают ее 0,25% раствором трипсина в соотношении 1:10 -1:15. Дезагрегацию ткани проводят дробно с применением магнитной мешалки при температуре 35-37 С до полного истощения ткани. Для этого проводят 7-8 циклов по 10-15 мин каждый. Выход клеток из одного грамма почечной ткани составляют 40-50 млн.

Для выращивания клеток ПТ используют ростовую среду из гидролизата лактоальбумина с добавлением 10% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота. В данную среду вносят посевную дозу ПТ в концентрации 600-800 тыс. клеток/мл. Культивирование клеток ПТ осуществляется в матрасах при температуре 37 °С. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Смену ростовой среды проводят на 2 -3-й сутки. Контроль качества культуры осуществляют макро- и микроскопически.

После формирования монослоя культуру клеток отмывают раствором Хенкса дважды, удаляя тем самым сывороточный белок, препятствующий репродукции вируса после внесения его в культуру клеток.

В настоящее время все культуры клеток, используемые для выращивания и накопления вирусов можно разделить на следующие основные группы:

- первичная культура - такая культура клеток, для которой использованы клетки, органы или ткани, взятые непосредственно из организма;

- субкультура - клетки «первичной культуры», подвергнутые субкультивированию;

- клеточная линия - культура клеток, полученная из субкультуры;

- диплоидная клеточная линия - линия клеток, 75 % которых имеют кариотип, свойственный нормальной клетке организма, из которого они выделены;

- перевиваемая (стабильная) клеточная линия - бессмертная культура диплоидных клеток, которая в результате трансформации приобрела способность к неограниченному количеству пассажей (не менее 70 раз с 3-дневным интервалом);

- гетероплоидная клеточная линия - линия клеток, которая содержит менее 75%) диплоидных клеток. Такие клетки не обладают признаками новообразований. В то же время они не имеют ограничений способности роста in vitro.

По частоте использования клеточных культур они подразделяются на первичные (периодические) и перевиваемые (постоянные). Первые используются, как правило, однократно, то есть в технологическом процессе они используются разово. Вторые являются непрерывными, постоянными клеточными линиями, которые в технологическом процессе используются многократно.

Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормальных первичных клеток с ограниченным сроком жизни, являются трансформированными. Другими словами, они изменены по ряду признаков, главным из которых является «бессмертие» (Сергеев В.А., 1993). Другие категории трансформации (например, онкогенность, контактное торможение, приспособление к среде и т.д.) у различных линий проявляется неодинаково. Все они получены при спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие постоянные клеточные линии получены из опухоли животных.

Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной клеточной линии были успешными, когда первичную однослойную культуру получали путем посева механически измельченной суспензии трипсинизированных клеток.

Среды, применяемые для культивировании клеток

Сейчас в редких лабораториях культуральные среды составляются из индивидуальных компонентов в самой лаборатории. Если даже требуется специальная среда, лишенная той или иной аминокислоты, то и такую среду можно найти в каталогах промышленных фирм.

Повышенная стоимость таких сред перекрывается удобствами использования стандартных коммерческих сред (для всех производственников и исследователей, за исключением тех, которые сами изучают культуральные среды).

По этой причине не приводятся детальные методы составления сред из индивидуальных компонентов. Следует лишь иметь в виду, что вода, используемая для приготовления среды, должна быть вначале деионизована и затем перегнана в стеклянной посуде хотя бы один раз, и после этого она должна храниться в стеклянном или пластиковом контейнере.

В ранних исследованиях поддержание роста клеток обычно обеспечивалось экстрактами эмбриональных и взрослых тканей, но в настоящее время такие экстракты редко добавляются в культуральную среду - и то лишь для культивирования определенных первичных клеток.

Среда, используемая в наше время, помимо аминокислот, витаминов, солей и глюкозы, включает в себя. Как правило, сыворотку млекопитающих (до 10%), а в ряде случаев и другие добавки, такие, как бакто-пептон и триптозофосфат.

Начиная со среды 199, содержащей более 60 синтетических ингредиентов, в свободную продажу стали поступать и культуральные среды другого состава.

В 1955 г. Игл провел качественный и количественный анализ компонентов, обеспечивающих рост нескольких линий клеток млекопитающих. Предложенная им основная среда содержит 28 ингредиентов и требует добавления 5% сыворотки крупного рогатого скота.

Позднее Игл модифицировал эту среду, что позволило избежать ежедневной смены среды для поддержания роста культуры; эта минимальная среда Игла широко используется до настоящего времени.

В ряде исследований были предложены дальнейшие модификации среды Игла. Так, среда MEM Глазго, содержащая удвоенные по сравнению с БСИ концентрации аминокислот и витаминов и дополнительно глюкозу и бикарбонат, рекомендована для выращивания клеток хомячков ВНК21/С13.

МСИ в модификации Дюльбекко отличается от БСИ в 4 раза более высокой концентрацией аминокислот и витаминов, а также присутствием некоторых заменимых аминокислот и Fe(NO)₃)3. Эта среда рекомендована для размножения вируса полиомы в клетках хомячка.

Сбалансированные солевые растворы. Среды составляются на основе сбалансированных буферных солевых растворов (СБСР), которые, помимо снабжения клеток необходимыми ионами, важны также для поддержания осмотического баланса.

В некоторых случаях в сбалансированный раствор солей добавляется глюкоза. Однако лучше добавлять стерильный раствор глюкозы вместе со стерилизованным в результате фильтрования раствором бикарбоната натрия после того, как остальные ингредиенты будут стерилизованы путем автоклавирования.

Состав солевых растворов модифицировался в течение многих лет, и в настоящее время наиболее употребительными оказываются СБСР Эрла, СБСР Хэнкса и специальный СБСР, предложенный Иглом для суспензионных культур. Они поставляются обычно в форме 10-кратных концентратов без бикарбоната. Такой исходный раствор разбавляют дистиллированной водой и автоклавируют, после чего в него добавляют бикарбонат и глюкозу.

Весьма важно поддерживать правильное значение рН культуральной среды в диапазоне 7,2 - 7,5, что достигается обычно с помощью системы бикарбонат/С0₂. При концентрации С0₂ в воздухе 5% эта система обеспечивает рН среды 7,4 (при этом рН среды, благодаря присутствующему в ней феноловому красному, окрашена в темно-красный цвет). При подщелачивании среды ее цвет меняется на красный и далее на пурпурно-коричневый, а при подкислении среды она становится желтой.

Поскольку растущие клетки вырабатывают кислоту, в некоторых случаях возникает необходимость увеличения концентрации бикарбоната в среде для обеспечения поддержания надлежащего рН. Фосфаты в СБСР также способствуют поддержанию рН и, кроме того, обеспечивают клетки необходимыми для них ионами фосфора.

Ионы Na⁺ и в меньшей степени К⁺, будучи незаменимыми в некоторых внутриклеточных реакциях, имеют важное значение также для поддержания осмотического баланса клеток. Изотоническая концентрация ионов Na⁺ в СБСР обеспечивается главным образом NaCl, но в СБСР Эрла источником Na⁺ служит также NaHC0₃, а в меньшей степени и другие соли. Увеличение концентрации Na от 120 мМ (нормальной) до 220 мМ ведет к диссоциации полирибосом с последующим ингибированием синтеза белка и роста клеток.

Ионы Са²⁺ необходимы для прикрепления клеток к стеклянной или пластиковой поверхности и в связи с этим не входят в состав СБСР для суспензионных культур; в таких СБСР концентрация фосфата увеличивается обычно в 10 раз.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Дюльбекко сходен с СБСР Хэнкса, но в ФСБ отсутствует бикарбонат, а содержание Na2HP04 и КН₂Р0₄ повышено для обеспечения большей буферной емкости. ФСБ не используется в качестве основы для культуральных сред, но часто применяется для промывки клеточного монослоя.

Методика заражения культур клеток вирусом

Заражение однослойных культур клеток нужно производить сразу: после образования монослоя. При получении культур клеток из эмбриональной ткани целесообразно более раннее их заражение вирусом» а именно, когда 80 - 90 % поверхности субстрата покрыто монослоем. Это делается для того, чтобы прекратить чрезмерно интенсивный рост клеток.

Процедура заражения клеток проста. Постовую среду сливают, а монослой культуры клеток промывают фосфатно-буферным раствором. Эту процедуру повторяют 2-3 раза. При этом удаляются белки сыворотки, продукты обмена клеток (как возможные ингибиторы вирусов). Затем на монослой наносят вируссодержащий материал, оставляют на 1 - 4 ч при комнатной температуре или 37 °С. Этим преследуется цель предоставить вирусу возможность максимально адсорбироваться на клетках культуры.

Затем исследуемую вирусную суспензию сливают, клетки промывают каким-либо стерильным буферным раствором для удаления остатков исследуемого материала и монослой заливают поддерживающей питательной средой. Пробирки или другие стеклянные емкости закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при температуре 37 °С.

Контроль за ходом заражения культур клеток вирусом осуществляется сравнением их с интактными клетками под микроскопом для выявления так называемого цитопатогенного действия (ЦПД) вируса.

По вызываемым изменениям в клеточной культуре вирусы делятся на три группы:

вызывающие ЦПД (повреждение клеток);

вызывающие пролиферацию клеток;

не вызывающие видимых морфологических изменений.

Вирусы, вызывающие ЦПД, обнаруживаются по морфологическим изменениям клеток, которые вначале выражаются округлением клеток, четкой их контурностью. Затем в клетках появляются дегенеративные изменения внутри клеток - зернистость, вакуольные перерождения. При этом зернистость может быть мелкой, крупной, единичной, множественной. В последующем указанные дегенеративные изменения переходят в более заметные, вплоть до их цитолиза и отслаивания от стекла.

Некоторые вирусы вызывают лишь начальные изменения клеток (например, только зернистость или округление), которые не прогрессируют, несмотря на дальнейшее развитие вируса.

Иногда в клеточной культуре наблюдают процесс регенерации, то есть уменьшение изменений в монослое клеток в связи с пролиферацией клеток (образование многослойных клеточных скоплений). Поэтому наблюдения за изменениями в клетках должны проводиться под микроскопом ежедневно.

Особым вариантом цитопатогенного эффекта является образование гигантских клеток (синцитий), содержащих до одной тысячи ядер, а также телец - включений (ядерных или цитоплазматических).

Отсутствие изменений в культуре клеток свидетельствует или об отсутствии в исследуемом материале вируса, или его недостаточной концентрации, или о неспособности данного вируса вызывать ЦПД. В последнем случае наличие вируса в культуре клеток устанавливают с помощью реакции гемадсорбции (РГАд) или методом флуоресцирующих антител (МФА). Причем РГАд иногда выявляет наличие в клетках до проявления им ЦПД.