Тема 6. Культивирование вирусов в организме животных.

Цикл размножения вирусов.

Из всех инфекционных болезней животных более 50 % приходится на болезни вирусной этиологии, поэтому изучение вирусных болезней, методов их диагностики и профилактики имеет особое значение. В настоящее время разработаны и широко применяются методы производственного выращивания ряда вирусов животных и человека с целью изготовления противовирусных препаратов. Учитывая исключительную практическую важность исследований и разработок в этой области, они постоянно направлены на поиски новых принципов и технологических решений.

Производство вирусных препаратов - сложный многоступенчатый процесс. Сначала в лабораторных условиях готовится посевной материал (как клеточный, так и вирусный). Затем следуют стадии основного процесса: последовательное накопление клеточного материала (культивирование клеток), ресуспендирование клеток в свежей питательной среде и культивирование вирусов. На заключительных стадиях приготовления препарата проводят очистку, концентрирование, инактивацию и сушку (при необходимости), расфасовку, упаковку и контроль.

В течение всего процесса производства проводятся разнообразные мероприятия, обеспечивающие сохранение чистоты культуры на всех этапах технологического цикла - от хранения пробирки с эталонным штаммом в лаборатории и промышленного выращивания вирусов в биореакторах, до получения готовой лекарственной формы биопрепарата.

Вирус - это облигатный внутриклеточный паразит, геном которого представлен одним видом нуклеиновой кислоты ДНК или РНК.

Понятие «вирус» не исчерпывается только описанием вирусных частиц. Вирионы - инертные формы, в которые превращается вирус при переходе из одной клетки-хозяина в другую; они не участвуют в обменных реакциях и сами по себе не размножаются. Репродукция (воспроизведение) вирусов происходит внутри клеток.

Процессы репродукции ДНК- и РНК- содержащих вирусов существенно различаются в отношении транскрипции и репликации их геномов.

После адсорбции вирус проникает в клетку путем слияния с мембраной. Нуклеокапсид транспортируется к ядерной оболочке и вирусная ДНК (вДНК) проникает в ядро клетки, где начинается ее транскрипция клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразной.

Вначале транскрибируются «ранние». В результате трансляции «ранней порции» вирусного генома синтезируются «ранние белки», включая регуляторные, матричные и вирусные полимеразы. Вирусная полимераза проникает в геном клетки, где запускает синтез молекул ДНК дочерних популяций. Часть вирусной ДНК («поздние гены») дочерних популяций транскрибируется клеточной РНК-полимеразой, что приводит к синтезу «поздних белков», необходимых для сборки дочерних популяций. Последние покидают ядро, отпочковываясь от его мембраны, фрагменты которой содержат в составе своей оболочки.

После адсорбции вирус проникает в клетку путем виропексиса. Вирусная +РНК высвобождается в цитоплазме. Поскольку молекулярная симметрия вирусной +РНК аналогична мРНК, то +РНК может непосредственно распознаваться и транслироваться рибосомами. Образуется гигантская полипротеиновая молекула. Клеточные протеазы «нарезают» образующийся вирусный полипротеин с образованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, вирусной протеазы, ингибиторов синтеза клеточных РНК и различных структурных белков. РНК-полимераза катализирует образование-РНК на матрице родительской +РНК. Затем уже на матрице-РНК происходит многократный синтез молекул +РНК, участвующих в синтезе вирусных белков, либо входящих в состав генома дочерних популяций вирусов.

Проникновение вируса в клетку происходит после его адсорбции и слияния с клеточной оболочкой. После высвобождения вирусной – РНК происходит синтез +РНК на матрице-РНК, катализируемый РНК-зависимой РНК-полимеразой, входящей в состав вириона, что приводит к образованию полных и коротких нитей. Короткие РНК-нити участвуют в синтезе ферментов и белков для дочерних популяций. Среди последних особую значимость имеют белок М и гликопротеины оболочки, встраивающиеся в клеточную стенку на этапах, предшествующих отпочковыванию. Полная цепь +РНК служит матрицей для синтеза молекул-РНК дочерних популяций. Вирионы дочерних популяций собираются на участках клеточной мембраны, модифицированных белком М (6), и высвобождаются почкованием, захватывая её фрагмент, служащий в дальнейшем суперкапсидом.

Чтобы обеспечить заражение каждой клетки и высокую степень синхронности последующих событий и популяции зараженных клеток, заражающая доза вирусов должна быть в пределах 10-100 частиц.

Понятие эклипс отражает то факт, что вирион как бы исчезает на несколько часов до того момента, когда появятся частицы вирусного потомства.

Термин латентный период характеризует интервал между исчезновением внесенных вирионов и выходом в среду новых вирусных частиц. Иногда большая часть вирионов остается внутри клетки-хозяина в течение всего периода размножения вируса

Термин «урожай вируса» характеризует число вирусных частиц или

число инфекционных единиц, обнаруженных в одной клетке.

Вирусы выходят из клетки на поздней стадии и не полностью. В других случаях, когда вирионы созревают в процессе выхода из клетки, кривые для внутриклеточной и внеклеточной инфекции совпадают.

Цикл размножения состоит из нескольких стадий:

- прикрепление (адсорбция) вируса на поверхности клетки;

- проникновение вируса в клетку;

- освобождение вируса от белковой оболочки (раздевание), что приводит к эклипсу, при котором происходит транскрипция специфических последовательностей родительской вирусной ДНК или РНК с образованием мРНК;

- трансляция мРНК и появление кодируемых вирусом ферментов и других ранних вирусных белков;

- репликация вирусной ДНК или РНК;

- дальнейшая транскрипция дочерней и родительской нуклеиновой кислоты;

- трансляция образующихся при этом поздних мРНК и накопление структурных и других кодируемых вирусом белков, часть которых обладает регуляторными функциями;

- самосборка вирусных белков вокруг генома вируса;

- выход новых вирионов из клетки.

Схема цикла размножения ДНК-содержащих вирусов представлена на

рис. 1.

Транскрипция, трансляция и репликация вирусного РНК у РНК-содержащих вирусов идет разнообразными путями у вирусов различных родов.

Вирион

Прикрепление к клетке

Проникновение в клетку

Раздевание

Транскрипция

Репликация вирусной ДНК

Сборка и выход из клетки

Рис.1. Схема размножения ДНК- содержащих вирусов

Накопление вирусов в организме животных

В начале развития вирусологии метод заражения восприимчивых животных являлся единственным методом культивирования вирусов. Этот метод был необходим для изучения многих вопросов вирусологии, особенно при диагностике и изучении симптомов вирусных болезней, а также при изготовлении противовирусных вакцин. Однако метод накопления вирусов в организме животных сопряжен со многими трудностями (например, чувствительность отдельных подопытных животных и их различная реактивность, которая часто колеблется в широких пределах и вносит элемент непредсказуемости в результаты заражения животных).

Но, несмотря на указанные ограничения, и сейчас для накопления вирусов используют белых мышей и крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кроликов, собак, кур, голубей, обезьян, а также с/х животных - овец, телят, жеребят, поросят и др.

Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются животные, свободные от специфических патогенных возбудителей болезней (SPF-Spezifisch-pathogenfrei), а также животные-гнотобиоты (стерильные животные), получаемые от матерей асептически, кесаревым сечением, и содержащиеся в асептических условиях.

Подопытным животным вируссодержащий материал вводят оральным, ректальным, интраназальным, накожным, внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрибрюшинным способами, а также в мозг, на роговицу глаза, в тестикулы и др. методами.

Зараженных животных содержат изолированно от здоровых и за ними ведут клинические наблюдения. Признаками заражения являются развитие у животных типичных клинических симптомов болезни или гибель.

При производстве противовирусных биопрепаратов чаще всего животных используют для контроля, а иногда и для приготовления некоторых тканевых вирусных вакцин. Типичным примером является производство формолвакцины против ящура из вируса, полученного после заражения крольчат (латинизированный вирус), вакцины против оспы овец, геморрагической болезни кроликов и т.п.

Рассмотрим кратко технологию изготовления противовирусной вакцины из аттенуированного штамма С 113/86 вируса оспы овец, из которой готовят сухую живую вакцину против оспы овец. Для этих целей осуществляют заражение 5-6 овец вируссодержащей суспензией лиофилизированного вируса оспы указанного штамма, которую готовят путем разведения 1:100.

Предварительно у овец выстригают и выбривают шерсть со стороны брюшной полости и тщательно обрабатывают ее дезинфицирующей жидкостью. Вируссодержащий материал вводят внутрикожно в несколько точек в области брюшной стенки, вводя в каждую точку по 0,2 - 0,6 см3 вируса. Всего одной овце вводят 100 - 300 см³ вируса. После заражения за животными ведут клиническое наблюдение.

В соответствии со стадиями развития оспенного процесса на месте введения вируса через 3-4 сут развивается обильная кожная экзантема и на коже появляются красные пятнышки (roseola variolosa).

Примерно еще через 3-4 сут на месте заражения появляются плотные узелки (папулы), окруженные возвышающимся красным пояском (stadium papulosum).

На 7-10 сут, не ожидая следующих стадий развития оспенного процесса, животных убивают. У них препарируют пораженную кожу и со всей ее поверхности срезают папулы. От каждой овцы папулы отбирают в отдельные специальные емкости. Собранный материал хранят при температуре -40 °С до получения из него вакцинного препарата.