Тема 16. Технология приготовления пробиотиков

Пробиотики широко используются в ветеринарии для стимуляции роста и развития молодняка животных, профилактики желудочно-кишечных заболеваний, восстановления кишечного биоценоза при стрессах, антибиотикотерапии. Пробиотики являются экологически чистыми препаратами, не оказывают побочного эффекта при длительном и регулярном их применении и могут заменить антибиотики в общей схеме неспецифической профилактики желудочно-кишечных болезней (табл. 2).

Таблица 2.

Возможные механизмы действия пробиотиков

1. Подавление роста живых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов а)продукция антибактериальных компонентов б)конкуренция за источники питания в)конкуренция за рецепторы адгезии

2. Влияние на микробный антагонизм а)уменынение ферментативной активности б)увеличение ферментативной активности

3. Стимуляция иммунитета а)увеличение уровня антител б)увеличение активности

Эффективность применения различных пробиотиков широко варьирует и зависит от многих факторов, в том числе и от видового состава входящих в них микроорганизмов. Большинство известных в мировой практике пробиотиков содержит несколько видов бактерий-симбионтов, сочетание биологических свойств которых позволяет повысить эффективность препаратов. К числу наиболее известных относятся молочнокислые бактерии, бифидобактерии, стрептококки.

В последние годы в состав пробиотических препаратов все чаще включают аэробные спорообразующие бактерии, относящиеся к роду Bacillus, большинство представителей которых обладает антагонистическими, протеолитическими свойствами и способностью к выработке, широкого спектра антибиотикоподобных субстанций.

Кроме перечисленных видов бактерий, в ряде стран в составе пробиотиков для животных широко используют Saccaharomvces cervisiae, Candida pintolopesii. Aspergillus niger и Aspergillus orysae.

Пробиотики на основе молочнокислых бактерий

К молочнокислым бактериям, широко используемым для производства пробиотиков, относятся молочнокислые стрептококки и лактобактерии.

В молочной промышленности для изготовления различных продуктов из молочнокислых стрептококков наиболее часто применяют мезофильные стрептококки S.lactis и S.cremoris, которые относятся к группе гомоферментативных, разлагающих молочный сахар до молочной кислоты. В отдельных случаях они образуют небольшие количества летучих жирных кислот и ацетона; являются активными кислотообразователями, оптимальной температурой их роста явля-30°С - для S.lactis и 25°С - для S.cremoris.

Мезофильные гетероферментативные стрептококки (S.paracitrovorus, S.diacetilactis, S.acetoinicus, S.citrovorus) при расщеплении лактозы образуют молочную кислоту, при расщеплении лимонной кислоты образуют диацетил. Оптимальной температурой их роста является 30 °С, а для S.citrovorus и S.paracitrovorus - 21 - 25°С.

Кроме мезофильных к молочнокислым стрептококкам относятся и термофильные. Представлены они одним видом - S.thermophilus. Оптимальной температурой их роста является 40 - 45 °С. Колонии имеют тёмную зернистую структуру, в мазках клетки крупные, сплющены и располагаются цепочками разной длины. Являются сильными кислотообразователями.

К палочковидным молочнокислым бактериям относится род iobacterium.

К подгруппе термофильных палочек относятся L.bulgaricum и L.acidophilum, применяемые для приготовления кисломолочных продуктов, а также L.helveticum, используемые в сыроделии. Все они являются факультативными анаэробами. Плохо растут на поверхности агаровых сред, лучше в столбике агара. На поверхности плотных сред колонии локонообразные, а в глубине имеют форму кусочков ваты, то есть колонии R-формы. В мазках располагаются одиночными клетками или цепочками. Являются энергичными кислотообразователями (до 300°С), молоко сбраживают за 3 - 5 ч. Оптимальной температурой роста является 40° С (для L.acidophilum - 37 °С).

К подгруппе стрептобактерий относятся L.casei и L.plantarum, которые принимают участие в созревании сыра. Они представляют собой палочки разной длины, располагающиеся одиночно, попарно или в виде коротких и длинных цепочек. На плотных средах образуют мелкие круглые колонии (S-формы), иногда с выростом. Оптимальная температура роста около 30 °С. Являются слабыми кислотообразователями, не свёртывают молоко. По своим свойствам близки к ароматобразующим стрептококкам.

В настоящее время у всех видов молочнокислых бактерий найдены бактериофаги. Они являются строго специфичными, и поэтому с помощью явления бактериофагии можно дифференцировать молочнокислые бактерии. Основополагающим является то, что бактериофаги нарушают молочнокислое брожение при производстве творога, простокваш, сыров с низкой температурой второго нагревания.

Для более точной идентификации молочнокислых бактерий используют серологические методы. Наиболее приемлемой является реакция преципитации. Установлено, что по этой реакции молочнокислые стрептококки более однородны, чем молочнокислые палочки.

В России чистые культуры молочнокислых бактерий стали применять с 1890 г. Большой вклад в разработку способов приготовления чистых культур, сохранения их в сухом виде и использования в производстве кисломолочных продуктов внёс С.А. Северин.

И.И. Мечников, занимаясь проблемой старости у людей, считал, что молочная кислота и другие продукты обмена молочнокислых бактерий, содержащиеся в простоквашах, подавляют гнилостную микрофлору кишечника и предотвращают преждевременное старение организма.

Однако многочисленные опыты, проведённые позже И.И. Мечниковым, показали, что болгарская палочка, вводимая в организм простоквашей, не обладает специфической способностью приживляться в кишечнике и исчезает из него вскоре после того, как прекращается пребывание в нём простокваши.

По данным американских учёных (Н. Копелов, Ф. Бирмарк, Л. Кальп, Л. Ретжер, В. Альбус), эта способность в гораздо большей степени присуща ацидофильной палочке, как естественному представителю молочнокислых бактерий в нормальном кишечном биоценозе. По природе Lactobacterium acidophilum идентична болгарской палочке, но она уже адаптирована к условиям жизни в кишечнике.

Наряду с молочной кислотой многие кисломолочные продукты содержат специфические антибиотические вещества, подавляющие вредную микрофлору кишечника, в том числе и возбудителя туберкулёза.

Кисломолочные продукты широко применяются как для лечебного питания, так и для лечения людей и животных при ряде заболеваний. Так, кумыс, ацидофильно-дрожжевое молоко применяются при лечении туберкулёза, а ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильная паста — как лечебно-диетические продукты при колитах, Дизентерии, диспепсии у людей. Эти же кисломолочные продукты могут быть использованы и для лечения животных, особенно молодняка, при различных желудочно-кишечных заболеваниях.

Кроме того, для лечения молодняка животных при кишечных расстройствах применяются чистые ацидофильно-бульонные культуры (АБК), биобактон, лактобактерин, ацидофилин и другие чистые культуры молочнокислых бактерий.

Особенно важным является применение молочнокислых бактерий на фоне интенсивного лечения людей и животных антибиотиками. Как известно, антибиотики в большинстве своём не имеют избирательного действия на микроорганизмы. Наряду с возбудителями болезней они вызывают гибель нормальной микрофлоры кишечника. В ряде случаев это приводит к дисбактериозам, а иногда и к заболеваниям типа кандидомикоза и других. Применение же молочнокислых бактерий даёт возможность восстановить нормальную микрофлору кишечника.

В настоящее время установлено, что наряду с молочной кислотой, молочнокислые бактерии способны продуцировать антибиотические вещества (бактериоцины), подавляющие рост гнилостных, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Так, S. lactis образуют антибиотик низин, S. cremoris - диплококкцин, L. plantanim - лактолин, L. acidophilum продуцирует антибиотические вещества, подавляющие рост возбудителей дизентирии, брюшного тифа, сальмонеллёза, колибактериоза.

Кроме того, следует знать, что молочнокислые бактерии в процессе размножения образуют ещё и ароматические соединения, придающие продукту приятный вкус и ароматичность (диацетил и ацетальдегид), синтезируют жирорастворимые витамины А, Д, Е, богатые соями кальция, фосфора, магния.

С помощью своих экзоферментов молочнокислые бактерии расщепляют молочный белок с образованием ароматических незаменимых аминокислот - тирозина и триптофана и цистеин.

Продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожения (кумыс, кефир, айран, чал) содержат молочную кислоту, углекислоту, следы спирта (до 0,4 - 0,6 %), которые вызывают сильное сокоотделение пищеварительными железами, что улучшает процесс пищеварения и усвоения человеком пищи или корма животными.

Селекция молочнокислых бактерий. Сырое молоко и молочные продукты издавна используются как источники выделения молочнокислых бактерий. Но молоко не является первоисточником этих бактерий.

Молочнокислые бактерии постоянно встречаются в почве, на растениях (цветах, листьях, стеблях, корневой системе). Чаще они сосредотачиваются в прикорневой зоне растений, а затем поднимаются на их надземную часть.

Впервые молочнокислые бактерии из природных источников растительного происхождения выделил и изучил их свойства В.М. Богданов (1959). Это послужило началом широкого использования отдельных растений для получения производственно-полезных штаммов молочнокислых бактерий.

Питательные среды для молочнокислых бактерий и технология, их получения. Для селекции молочнокислых бактерий очень важным является правильный выбор питательных сред и условий культивирования. Чаще всего для выделения молочнокислых бактерий из природных источников используют стерильное обезжиренное молоко.

При культивировании гетероферментативных молочнокислых бактерий, для которых характерно сбраживание солей лимонной кислоты, в питательные среды добавляются лимоннокислый натрий (1%), а в отдельных случаях и дрожжевой гидролизат (2 %). На таких же средах осуществляют молочнокислых бактерий с целью получения заквасок для производства различных молочнокислых продуктов - творога, сметаны, йогурта, простокваши и др.

Кроме обезжиренного молока, для культивирования молочнокислых бактерий в промышленных условиях с целью получения пробиотиков, применяют гидролизованное молоко. Для этого обезжиренное молоко стерилизуют при температуре 120 °С в течение 10-15 мин и охлаждают до 45° С. Обезжиренное молоко должно иметь слегка кремоватый цвет. Затем устанавливают рН до 7,6 - 7,8 и к обезжиренному молоку добавляют из расчёта на 1 литр 0,5 - 1 г панкреатита или 2 - 3 г поджелудочной железы. Через несколько минут в молоко добавляют хлороформ из расчёта 5 мл на 1 л. Такую смесь в бутылях, закрытых резиновой пробкой, выдерживают в термостате при 40°С в течение 24 ч. В первые часы молоко следует периодически перемешивать. Через 24ч гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. Такой гидролизат обычно прозрачный, реакция его нейтральная и слабокислая, содержит 11О -120 мг% аминного азота, срок хранения 1-2 недели.

Для приготовления из гидролизата молока питательной среды его разводят деминерализованной водой в отношении 1:1 - 1:2 и устанавливают рН = 6,8 - 7,0. При необходимости вводят различные добавки. Питательную среду стерилизуют при 110°С в течение 30 мин. Это делается для предотвращения образования в среде белково-сахарных комплексов, отрицательно влияющих на рост молочнокислых бактерий.

Технология изготовления биобактона. Биобактон представляет собой лифилизированную культуру ацидофильной палочки, обладающей высокими антибиотическими и кислотообразующими свойствами. Для его приготовления используют обезжиренное молоко или среду на основе гидролизата молока по описанному выше методу. Культивируют L.acidophilum при 37°С в течение 10 - 15 ч. При этом в процессе культивирования среду периодически нейтрализуют кальцинированной содой, что обеспечивает накопление микробных клеток до 3 млрд/мл (этот процесс автоматизирован). Отделяют микробные клетки ацидофильных бактерий в стационарную фазу, т.е. через 10 - 15 ч культивирования. В этот период микробные клетки являются более активными и стойкими к замораживанию.

Бактериальную массу концентрируют на суперцентрифугах (сепараторах) производительностью 200 - 800 л/ч, работающих при частоте вращения ротора 16000 об/мин. Полученный концентрат ацидофильной палочки обычно содержит 250-300 млрд клеток в 1 г.

Чаще всего биобактон выпускают в лиофильно высушенном виде. В качестве среды высушивания используют молочный обрат с сахаром или сахарозо-желатиновую среду.

Концентрированную биомассу разбавляют средой высушивания 1:6, расфасовывают но флаконам, а затем подвергают лиофильной сушке. После этого флаконы закрывают резиновыми пробками, обкатывают для герметичности алюминиевыми колпачками. Проводят контроль на стерильность, биологическую концентрацию бактерий (количество живых микроорганизмов), антагонистическую активность, влажность и др.

Технология изготовления лактобактерина. Лактобактерин - это пробиотик, выпускаемый отечественной промышленностью. В состав лактобактерина для животных входят 2 вида лактобактерий -L.plantarum и L.fermenti.

Технология производства лактобактерина во многом аналогична

биобактану.

К ультивирование микроорганизмов (2сут)

П одготовка посевного материала

П риготовление питательной среды

Выделение и концентрирование лактобактерий

Лиофильное высушивание

Придание готовой лекарственной формы

Фасовка, упаковка, этикетирование

Контроль готовой продукции

Схема производства лактобактерина

Контроль качества лактобактерина проводят по таким показателям, как биологическая концентрация, отсутствие посторонней микрофлоры, антагонистическая активность.

Технология производства бифидумбактерина

Бифидумбактерин представляет собой лиофилизированную микробную массу живых бифидобактерий. Бифидумбактерин предназначен для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней у человека и животных.

По внешнему виду препарат представляет собой кристаллическую или пористую массу бежевого или беловато-серого цвета. В состав препарата входят сахароза и желатин, которые являются компонентами стабилизирующей среды высушивания. Препарат выпускают в виде сухой биомассы, лиофилизированной в ампулах или флаконах. Массовая доля влаги сухого препарата должна быть не более 3,5 %.

Все работы, связанные с пересевом, разведением, определением физико-химических характеристик бифидумбактерина, требуют соблюдения стерильности и проводятся в вытяжных шкафах или на лабораторных столах над кюветами, на дно которых помещены коврики, смоченные 10%-ным раствором перекиси водорода.

Технология производства бифидумбактерина включает следующие стадии: приготовление питательных сред, выращивание посевного материала, культивирование, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм, контроль готового препарата.

Приготовление питательных сред. Для культивирования бифидобактерий используют среду Блоурокка или среду на основе гидролизата казеина (гидролизатно-молочную или гидролизатно-дрожжевую).

В состав среды Блоурокка входят агар микробиологический, натрий хлористый, пептон сухой, лактоза, печеночный бульон, цистии. Срок хранения питательной среды не более 7 сут при температуре (20±5)°С.

Срок хранения сред на основе гидролизата казеина не более 72 ч при температуре (20 ± 5) °С.

Стадия выращивания посевного материала. Посевы бифидобактерий инкубируют при температуре (38 ± 1)°С в течение (60 ±12) ч. Контрольные посевы инкубируют при температуре (22 ± 2)°С в течение 8 сук. При этом получают бифидобактерий 1 -ой генерации.

Следующий этап - получение бифидобактерий 2-ой генерации. Засев культуры проводят из расчета 10% от объема среды. Культура бифидобактерий и контрольные посевы инкубируют при той же температуре в матрасах, что и для посева 1-ой генерации. Общее время также аналогично времени для посевов 1-ой генерации. Контроль посевной культуры проводится при высевании бифидобактерий 2-ой герации в пробирки с глюкозой, средой Сабура и приготовлении мазка окрашенного по Граму.

При отсутствии роста в контрольных пробирках и наличии типичного роста бифидобактерий в виде рыхлого зернистого осадка, полученную культуру используют для посева в биореактор.

Культивирование. Культивирование бифидобактерий проводят в биореакторах марки БИОР. После проверки на герметичность и обработки фильтров биореактор стерилизуют при 130 °С в течение 90 мин. Затем в него вводят гидролизатно-молочную или казеиново-дрожжевую среду. Засев питательной среды проводят бифидобактериями 2 - 3-ей генерации.

После культивирования проводят контроль биомассы. Биологическая

концентрация бифидобактерий должна быть не менее 10⁸ клеток/мл, посторонняя микрофлора должна отсутствовать, рН = 7,1 ±0,1. Затем готовят среду высушивания и вводят в биореактор. Биомассу со средой высушивания перемешивают (3 ± 0,5) мин механической мешалкой, разливают в стерильные емкости аппарата «Магнолия» и передают на участок розлива в ампулы.

Сублимационное высушивание биомассы. Розлив биомассы в ампулы производится при постоянном перемешивании. В начале, середине и конце розлива отбирают пробы для определения посторонней микрофлоры и жизнеспособности бифидобактерий, равномерности и точности розлива. Заполненную ампулами кассету прикрывают несколькими слоями стерильной марли, металлической крышкой и передают для замораживания в низкотемпературную установку Масс-5, где выдерживают препарат при температуре минус (40 ± 1)в течение (48 ±2) ч.

Высушивание проводят при давлении (13,3 ± 0,13) Па и температуре минус (30 ± 4) °С в течение (24 ± 2) ч, далее температуру повышают до +(28+2)°С в течение (16 ±2) ч и выдерживают (20 ± 2) ч.

После окончания процесса высушивания производится запайка ампул. Герметизацию ампул осуществляют не позднее 72 ч после окончания лиофилизации на автомате для запайки ампул в атмосфере азота.

Получение готовой лекарственной формы. Пятой стадией производства бифидумбактерина является маркировка и упаковка препарата. В помещении контроля производят проверку герметичности ампул и визуальный контроль.

Ампулы, прошедшие контроль и осмотр, отправляют на маркировочную машину, затем укладывают по 10 штук в пачки из картона. В каждую пачку вкладывается инструкция по применению препарата.

Контроль готового препарата осуществляется по следующим показателям:физические свойства, внешний вид, отсутствие посторонней микрофлоры, количество живых бифидобактерий в одной дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажнеть, рН, герметичность.

Технология производства пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus

Во всем мире продолжается работа по созданию новых пробиотиков. Важным арсеналом разработки и совершенствования биопрепаратов являются бактерии рода Bacillus. Свойства некоторых штаммов этой группы бактерий настолько разносторонни, что только за последние годы на их основе разработано более десятка эффективных препаратов (табл. 3).

Таблица 3.

Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus

Препарат	Микроорганизм	Страна-производитель
Медицинские
Споробактерин	B.subtilis	Россия I
Бактиспорин	B.subtilis	Россия
Биоспорин	B.subtilis, B.licheniformis	Украина
Гинеспорин	B.subtilis	Украина
Энтерогермин	B.subtilis	Италия
Флонивин	B.subtilis	Югославия
Бактисубтил	B.cereus	Франция
Цереобиоген	B.cereus	Китай
Ветеринарные
Энтеробактерин	B.subtilis	Россия
Биод-5	B.subtilis, B.licheniformis	Россия
Бактерин-СЛ	B.subtilis, B.licheniformis	Украина
Эвдоспорин	B.subtilis	Украина
БПС-44	B.subtilis	Украина
Глоген-8	B.natto	США
Прималас	B.subtilis	Нидерланды
ГГротексин	B.subtilis	Нидерланды

Важнейшими свойствами некоторых штаммов бацилл являются: антагонистическая активность ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам; высокая ферментативная активность, позволяющая существенно регулировать и стимулировать пищеварение; противоаллергенное и антитоксическое действия и ряд других.

Биоспорин применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника человека, вызванной нерациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесенными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций. Однако установлено, что спектр показаний для применения пробиотиков в клинической практике может быть существенно расширен. Так, выявлены их позитивные эффекты при лечении ревматоидного артрита, некоторых инфекций мочеполовых путей, гнойно-воспалительных осложнений в хирургической практике, гинекологических заболеваниях инфекционной природы и многих других.

Биод-5 - новый пробиотик ветеринарного назначения, разработанный сотрудниками кафедры биотехнологии МГАВМиБ имени Скрябина, включает два штамма бацилл - B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11.

Препарат предназначен для лечения животных, больных острыми кишечными инфекциями, вызванных сальмонеллами, шигеллами, стафилококками и другими патогенными микроорганизмами, для восстановления нормальной микрофлоры кишечника.

Технология предусматривает раздельное культивирование B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 и смешивание их после стадии концентрирования в соотношении 3:1.

Приготовление питательной среда

Приготовление посевного материала

Процесс культивирования

Концентрация микробной суспензии

Приготовление жидкой рецептурной массы

Высушивание

Приготовление готовой лекарственной формы

Маркировка, упаковка и хранение препарата

Контроль

Схема технологического процесса производства Биод-5.

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе микроорганизмов и заданными свойствами, полученными методами генной инженерии. Первый такой пробиотик медицинскогр назначения Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов, характеризуется антивирусными свойствами. Этот препарат разработан в Институте микробиологии им. ДЛС Заболотного НАН Украины совместно с НПО «Вектор» (Россия) ив настоящее время проходит с успехом клинические испытания.

Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными заболеваниями человека и животных.