ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Биотехнология

(учебное пособие часть II)

по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза,

квалификация «Бакалавр»

Казань - 2013 г.

Учебное пособие «Биотехнология» часть II (практикум) написано профессорами Госмановым Р.Г. и Галиуллиным А.К. и предназначено для студентов, обучающихся по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза, квалификация «Бакалавр».

Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины КГАВМ им. Н.Э.Баумана от 20 ноября 2013 г., протокол № 10.

Рецензенты: проф. И.Н. Никитин

Темы лабораторно – практических занятий

Тема 1. Приготовление посевного материала

И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Стадия приготовления посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают на биопредприятие в виде чистых культур, законсервированными в ампулах. Каждая культура штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и транспортировки.

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

- на скошенном агаре при температуре -1 - -5 °С;

- замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже -20 ° С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

- лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

Тема 2. Классификация способов и систем

КУЛЬТВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для осуществления любого биотехнологического процесса мик-робного синтеза необходимы культура микроорганизмов, питательная

среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда (например, при производстве бактериальных препаратов) целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях - продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, ферменты, аминокислоты и др.). При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на стадии культивирования. Основная задача на последующих стадиях состоит в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.

Классификация способов и систем культивирования

микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов осуществляется следующими основными способами: поверхностное, глубинное, периодическое, отъемно-доливное и непрерывное.

При твердофазном поверхностном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ.

При жидкофазном поверхностном культивировании микроорганизмы растут на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма.

При глубинном культивировании микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, а источники газообразных продуктов питания (кислород, углекислый газ, азот) и компоненты питательной среды поступают к микроорганизмам в результате аэрации и перемешивания.

Глубинный способ культивирования микроорганизмов наиболее широко используется в производстве большинства биопрепаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить за более короткое время большее количество бактериальной массы или продуктов биосинтеза. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в поверхностных условиях, количество микробов не превышает 1-2 млрд в мл применением глубинного культивирования, в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования, достигает 50-60 млрд. в мл.

2.Возможность осуществить управляемое культивирование, при котором основными управляющими воздействиями являются: аэрация, перемешивание, подача хладоагента или теплоносителя, титрантов для регулирования концентрации водородных ионов (рН), редуцентов для регулирования окислительно-восстановительного потенциала (еН) культуральной жидкости, пеногасителей для регулирования уровня пены в биореакторе, дозирования необходимых для оптимального роста культуры микроорганизмов азотных, углеводных, фосфорных и других субстратов, а также предшественников биосинтеза.

3.Возможность использования стандартного механизированного и автоматизированного технологического оборудования для культивирования (инокулятор, биореактор, что обеспечивает снижение подготовительных операций и операций съема биомассы) и повышения качества биопрепарата.

Для роста биомассы и биосинтеза продуктов метаболизма при культивировании необходимо соблюдение следующих условий:

- жизнеспособность посевного материала;

- наличие источника энергии;

- содержание в питательной среде компонентов, необходимых для синтеза биомассы;

- отсутствие в среде ингибиторов;

- поддержание в культуральной жидкости необходимых физико-химических условий жизнедеятельности культуры микроорганизмов.

Параметры роста

Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов, можно подразделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные структурой и специфическими особенностями организма, и внеклеточные факторы, т.е. условия внешней среды клетки. К внутриклеточным факторам относятся структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики, что является прерогативой цитологических, биологических и генетических исследований. Основной целью исследований в биотехнологии являются внеклеточные (внешние) факторы.

Для количественной характеристики роста микроорганизмов анализируются основные параметры роста.

Контроль роста. Под определением «биомасса» подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твердой или жидкой питательной среде при культивировании. Выбор метода измерения зависит от задач исследований в области культивирования, биохимической характеристики культуры, питательной среды и требуемой точности измерений. Наименее чувствительным является метод определения веса сухой биомассы, а наиболее чувствительным – метод подсчета клеток.