Клінічна трансплантаційна імунологія

 Основне завдання клінічної трансплантаційної імунології на доопераційному етапі – селекція максимально сумісної за HLA-антигенами пари «донор-реципієнт».

А. Оцінка сумісності донор-реципієнт:

1.      Сумісність груп крові за системою АВО.

2.      Типування тканин шляхом визначення HLA-антигенів.

3.      Виявлення передіснуючих антитіл до HLA-антигенів донора у сироватці реципієнта у крос-матч (cross-matching) реакції (принцип описаний далі).

4.      Якщо сироватка реципієнта не знищує донорських лімфоцитів (або якщо донор і реципієнт є однояйцевими близнюками), застосовують реакцію змішаних лімфоцитів (MLR, mixed lymphocyte reaction) для визначення стимуляції клітинами донора бластоутворення лімфоцитів у реципієнта (принцип описаний далі).

Б. Визначення імунного статусу реципієнта. Він значною мірою залежить від захворювання, що викликало необхідність трансплантації. Наприклад, наявність автоантитіл при автоімунних захворюваннях зумовлює відторгнення трансплантата навіть при повній сумісності донора і реципієнта.

В. Визначення абсолютних і відносних протипоказань до трансплантації. Серед основних причин – чинники, пов’язані з вираженою декомпенсацією кількох життєво важливих органів чи систем (серцево-судинної, дихальної та ін.), іноперабельні онкозахворювання, активні інфекційні процеси. Так, реплікативна форма гепатиту В вважається відносним протипоказанням до гепатотрансплантації, оскільки в такому випадку відбувається реінфекція трансплантованої печінки з наступною втратою її функції. Зрозуміло, що у випадку пересадки органів (серце, нирка, печінка) недостатність їх попередників вважається показанням, а не протипоказанням до трансплантації.

Антигени груп крові

У крові розрізняють аглютиногени А і В. Вони належать до найсильніших тканинних антигенів, оскільки представлені не тільки на еритроцитах, але і на клітинах більшості тканин. А тому антитіла до них (ізогемаглютиніни), відповідно, часто виявляються і повинні обов’язково визначатися у реципієнтів.

Кров донора і реципієнта тестується в реакції аглютинації як на визначення антигенів А і В, так і антитіл (гемаглютинінів).

Антигени тканинної сумісності

Забір клітин і сироватки крові для типування має певні особливості. Найкраще використовувати клітини з периферичної крові, лімфатичних вузлів, селезінки або тимусу. Вибір цих клітин обумовлений двома факторами: по-перше – доступністю для забору, по-друге – високою щільністю HLA-антигенів на їх поверхні.

Для HLA-типування найчастіше використовується сироватка крові таких донорів:

-  жінок, які багато разів вагітніли. Під час вагітності лімфоїдні клітини плода, потрапляючи через плаценту в організм матері, сенсибілізують її. Найвідомішим прикладом цього феномену є резус-конфлікт. Поки що невідомі захворювання, пов’язані із сенсибілізацією до HLA-антигенів;

Плід є аллографтом, який не відторгається.

-  пацієнтів, які отримували багаторазові переливання крові, сенсибілізуються чужими HLA-антигенами при кожній гемотрансфузії;

-  добровольців, сенсибілізованих за допомогою гемотрансфузій, введень лімфоцитів чи пересадки мікротрансплантатів.

Розрізняють дві групи методів, що різняться за принципом типування. До першого належать серологічний, клітинний та біохімічний методи для виявлення продуктів HLA-молекул, експресованих на мембрані клітини. Методи другої групи – молекулярно-біологічні (ампліфікаційні) – визначають алелі HLA безпосередньо з геномної ДНК. У клінічній практиці І класу HLA на сьогодні найчастіше вживаються серологічний (лімфоцитотоксичний тест) та молекулярно-біологічний (полімеразна ланцюгова реакція) методи. Основним принципом серологічних методів (наприклад, лімфоцитотоксичного тесту) є ідентифікація експресованих на мембрані молекул HLA за допомогою специфічних антитіл.

Лімфоцитотоксичний тест призначений для ідентифікації HLA-антигенів І та ІІ типів:

1.    Очищені лімфоцити інкубуються з набором (панеллю) антисироваток з відомою HLA-специфічністю. Якщо в антисироватці є антитіла до HLA-антигенів тестованих лімфоцитів, то вони фіксуються до лімфоцитарної мембрани.

2.    Після додавання комплементу ті лімфоцити, до яких зафіксувалися антитіла, руйнуються.

3.    На наступному етапі додають синій трипан або еозин – барвники, що селективно абсорбуються лише пошкодженими або мертвими клітинами.

4.    HLA-типування проводиться шляхом визначення тих комбінацій «лімфоцити-сироватка», які зумовлюють руйнування клітин.

Недоліком методу є залежність від експресії молекули HLA на поверхні клітини. Це стає на заваді типуванню при слабкій експресії або в разі її відсутності, наприклад при лікуванні кортикостероїдами. У пацієнтів з гематоонкологічними захворюваннями, спадковими дефектами диференціювання та дозрівання клітин, а також після терапії цитостатиками експресії може не бути. Для багатьох алелів не існує специфічних аллоантитіл. Наприклад, із 249 описаних DRB1 алелів тільки 24 (менше 10 %) визначаються серологічно, тобто мають відповідні серотипи. 

Ампліфікаційні методи. Полімеразна ланцюгова реакція забезпечує набагато достовірніші результати і дає змогу ідентифікувати всі відомі алелі кожного з локусів. Метод застосовують переважно для визначення гістосумісності при трансплантації кісткового мозку, рідше – нирок.

Існує 2 різновиди полімеразної реакції:

 із специфічними за послідовністю олігонуклеотидами;

 із специфічними праймерами.

Перший з них вважається надійнішим, проте для його проведення необхідно від 1 до 3 діб. Другий різновид забирає усього 1-2 год. Ще недано полімеразна ланцюгова реакція застосовувалася переважно для науковихдосліджень. Останнім часом вона знайшла широке застосування у клініці, особливо для вирішення спірних питань. Випробовуються нові ампліфікаційні методики, зокрема – лігазна ланцюгова реакція.

Реакція змішаних культур лімфоцитів (MLR, mixed lymphocyte reaction) застосовується для визначення більше 60 HLA-антигенів ІІ класу, кодованих D-локусом. Принципом методу є визначення мітотичної відповіді Т-клітин на чужі HLA-антигени. Так звані малі лімфоцити трансформуються у бластні клітини (бласттрансформація), які й виявляються у ході MLR. Розрізняють 2 варіанти цієї реакції:

1.      Якщо лімфоцити донора і реципієнта змішати у культурі клітин, то в обох групах лімфоцитів почнуться процеси бласттрансформації і проліферації за умови несумісності тканин (двоспрямований варіант тесту).

2.      Проте MLR звичайно проводиться у вигляді односпрямованого тесту, коли тільки одна група лімфоцитів у змішаній культурі може відповідати бласттрансформацією:

-  лімфоцити донора опромінюють або обробляють мітоміцином С для попередження бласттрансформації;

-  лімфоцити реципієнта зберігають здатність до бласттрансформації за умови несумісності тканин за антигенами HLA-D локусу. Сумісність тканин оберненопропорційна кількості бласттрансформованих лімфоцитів.

Крос-матч реакція (cross-matching). Сироватка реципієнта може містити так звані передіснуючі антитіла – їх поява найчастіше зумовлена сенсисибілізацією організму реципієнта множинними гемотрансфузіями, раніше проведеними трансплантаціями або багатьма вагітностями у жінок. Крос-матч реакція виявляє такі антитіла шляхом реєстрації компламентзалежної цитотоксичності при взаємодії сироватки реципієнта і лімфоцитів донора:

1.  Протягом певного часу забирають кілька зразків сироватки крові у майбутнього реципієнта. Усі зразки необхідно перевірити у крос-матч реакції з лімфоцитами донора, тому що титр антитіл може значно змінюватися з часом. Як результат – реакція може виявитися лише в одному з декількох випадків.

2.  Якщо хоча б в одному випадку виявляється лізис донорських лімфоцитів, трансплантація не проводиться.