Турбидиметрический метод определения количества иммуноглобулинов m, g, и a в сыворотке человека

Принцип метода.

Между иммуноглобулинами исследуемой сыворотки и антителами против них, которые содержатся в моноспецифических сыворотках, образуются иммунные комплексы. Эти комплексы в присутствии ПЭГ 6000 (полиэтиленгликоля с М.М. 6000 ), рассеивают проходящий свет, что регистрируется по увеличению оптической плотности (Д) раствора при определенной длине волны. Чем больше концентрация иммуноглобулинов в растворе, тем больше образуется иммунных комплексов, тем больше оптическая плотность, регистрируемая на ФЭКе.

Реактивы:

1.Фосфатный буфер с рН 7,4

2.6% ПЭГ на этом буфере.

3.Моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека ( производство НИИ им.Н.В.Гамалеи)

4.Стандартная сыворотка для построения калибровочной кривой.

Ход определения.

1.Приготовить разведения стандартной сыворотки на дистиллированной воде

1:2 1:4 1:8 1:16.

2.Развести моноспецифические сыворотки:

на Ig G - в 3 раза

на Ig А - в 3 раза

на Ig М - в 8 раз

3.В лунки планшета вносятся по 10 мкл приготовленных разведений стандартной сыворотки по 2 на каждое разведение ( Опыт и Контроль ) в 3 ряда ( для построения калибровочной кривой на Ig G, Ig A, Ig M ). В остальные лунки вносят по 10 мкл исследуемых сывороток ( О и К ). Количество заполненных лунок зависит от количества сывороток, поступивших на исследование.

Ig G

Ig A

Ig M

Ig G

Ig A

Ig M

Стандартная

неразведенная

О

К

О

К

О

К

Исследуемые

О

К

О

К

О

К

1:2

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

1:4

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

1:8

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

1:16

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

О

К

4.Затем во все лунки , предназначенные для определения Ig G , вносят по 10 мкл моноспецифической сыворотки на Ig G (разведенной в 3 раза), в лунки для определения Ig A - по 10 мкл моноспецифической сыворотки против Ig A ( разведенной в 3 раза), в лунки для определения Ig M - по 10 мкл сыворотки против Ig M (разведенной в 8 раз).

5.Затем во все опытные лунки внести по 200 мкл раствора ПЭГ, а в контрольные лунки- по 200 мкл фосфатного буфера.

6.Инкубация 1 час при комнатной температуре.

7.Определяют оптическую плотность при 405 нм , против контроля.

8.Строятся калибровочные кривые по "Е" разведенных стандартов. Определяется разница Е между опытом и контролем , а затем по калибровочным кривым определяется концентрация иммуноглобулинов