Определение содержания лизоцима

Метод основан на способности индикаторного микроба Micrococcus lisodeicticus растворяться в присутствии лизоцима. Активность фермента определяется на основе светопропускания взвеси бактерий в опыте по сравнению с контролем, регистрируемого на ФЭКе.

Клиническое значение.

Наблюдение за динамикой содержания лизоцима в крови позволяет определить напряженность неспецифической противомикробной резистентности и прогнозировать течение заболевания. Нормальное содержание лизоцима в сыворотке крови- 7-14 мг/л.

Состав набора для определения лизоцима.

1.Фосфатный буфер для лизоцима.

2.Биомасса Micrococcus lisodeicticus

3.Стандарт лизоцима.

Ход работы.

1.Приготовление микробной взвеси.

Достать из холодильника культуру микрококка. Смыть буфером для лизоцима. Профильтровать через вату в стер. колбу. Определить экстинкцию микробной взвеси на ФЭКе ( норма 0,6-0,7).

2.Приготовить 3 ряда пробирок, по 4 пробирки в каждом ( видалевские и одна большая для первого разведения лизоцима).

3.Во втором ряду приготовить разведения стандартного лизоцима. 1-й ряд -опытный, 3-й ряд- контрольный.

4.Во все пробирки 1-го и 3-го ряда вносим по 1,5мл взвеси микрококка. Затем в 1 ряд- по 0,1 мл исследуемой сыворотки, в 3-й ряд- по 0,1 мл разведений стандартного лизоцима.

5.Ставим пробирки на 30 мин. в термостат.

6. Определяем экстинкцию сначала в контрольном , а затем в опытном ряду.

1 ряд (опыты)	взвесь микрококка по 1,5 мл в каждую пробирку + 0,1 мл опытных сывороток
2 ряд (разведения стандарта лизоцима)	12,5 мл воды + 1 мл стандарта	1 мл воды + 1 мл разведения стандарта	1 мл воды + 1 мл разведения стандарта	1 мл воды + 1 мл разведения стандарта
З ряд (контроль для калибровки)	По 0,1 мл каждого разведения лизоцима + взвесь микрококка по 1,5 мл во все 4 пробирки

Определение уровня комплемента в сыворотке по 50% гемолизу

Принцип. Метод основан на прямой зависимости % гемолиза от количества сывороточ-

ного комплемента. Эта зависимость точно определена в зоне частичного гемолиза, соответствующего 50% гемолизу.

Реактивы:

1.Взвесь эритроцитов барана.

2.Гемолитическая сыворотка.

3.Веронал- мединаловый буфер.

Ход определения.

1.Развести фосфатный буфер дистиллированной водой 1:4 (10 мл буфера+ до 50 мл долить воды).

2.Приготовление гемосистемы:

а)приготовить 5% взвесь эритроцитов барана (0,5 мл эритр. взвеси+ до 10 мл фосфатного буфера). Затем проводиться стандартизация эритроцитарной взвеси: к 50 мкл

5% эритроцитарной взвеси + 150 мкл воды. На спектрофотометре опре деляют показатель светопреломления, он должен быть в пределах 0,7-0,72. Если он больше 0,7, то добавляют буфер, если он меньше 0,7 , то прибавляют эритроциты.

б)приготовить разведение гемолитической сыворотки (1 мл буфера + 0,01 мл гемолизи-рующей сыворотки)- получается разведение 1:1000 (титр гемолитической сыворотки 1:3000 должен быть усилен в 3 раза)

3.Смешать 50 мкл эритроцитов барана с гемолитической сывороткой ( сыворотку вливать в эритроциты). Хорошо перемешать, поставить в термостат при 37 град. на 30 мин. Развести буфером 1:1.

4.Развести сыворотку больного в 10 раз (0,1 мл сыворотки + 0,9 мл буфера, разведеннного 1:4).

5.Приготовить рабочие разведения сыворотки :

Разведения сыворотки	66	50	40	33	28	25	22	20
Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8
Сыворотка больного, разведенная в 10 раз (в мкл)	15	20	25	30	35	40	45	50
Буфер 1:4 (мкл рН=7,4	85	80	75	70	65	60	55	50

6.Прибавить во все лунки 100 мкл гемосмеси. Ставим в термостат при 37 град. на 45 мин.

7.Затем помещаем в холодильник на 10 мин.

8.Просматриваем лунки, выбираем лунку с гемолизом (без пуговки)

9.Определяем экстинкцию.

Смотрим на ФЭКе при длине волны 492 нм. Затем проводится расчет по формуле: Е/F. F=138. Определяем поправочный коэффициент(по таблице Мальтанера).

Методика определения уровня ЦИК в сыворотке крови

Принцип метода.

При определенной концентрации полиэтиленгликоль 6000 осаждает из сыворотки комплексы антиген-антитело. Затем с помощью фотометра определяют процент светопропускания. При увеличении содержания ЦИК процент светопропускания снижается.

Клиническое значение.

Образование иммунного комплекса- один из компонентов нормального иммунного ответа, заканчивающегося нейтрализацией или выведением антигена. Однако при увеличении уровня ЦИК в крови может формироваться ряд патологических процессов - ревматизм, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, гломерулонефрит, сывороточная болезнь и др. Показатель уровня ЦИК в сыворотке здоровых людей составляет 95-99%.

Реактивы:

1. Полиэтиленгликоль /ПЭГ 6000/

2. Боратный буфер рН-8,4

Ход определения:

1. В пробирку внести 5-6 мл крови без антикоагулянта. Кровь инкубировать в термостате при 37 град. в течение 2 часов для отделения сыворотки.

2. Полученную сыворотку развести в 3 раза буферным раствором/ 0,1 мл сыворотки + 0,2 мл боратного раствора/.

3. В контрольную пробирку внести 0,05 мл разведенной сыворотки и 0,45 мл боратного буфера.

4. В опытную пробирку внести 0,05 мл разведенной сыворотки и 0,45 мл ПЭГ.

5. Обе пробирки выдержать при комнатной температуре 1-2 часа. Затем фотометрически при 440-450 нм определить процент пропускания по шкале "Т", используя кюветы с длиной оптического пути 1,066 и 1,065. Расчет ведут, приняв пропускание контрольной пробирки за 100%