3.Определение уровня цик в сыворотке крови.

Образование иммунного комплекса - один из компонентов нормального иммунного ответа, заканчивающегося нейтрализацией или выведением анти- гена. Однако при увеличении уровня ЦИК в крови может формироваться ряд патологических процессов - сывороточная болезнь, ревматизм, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, гломерулонефрит.

Принцип метода.

При определенной концентрации полиэтиленгликоль 6000 осаждает из сыворотки комплекся антиген-антитело. Затем с помощью фотометра определяют процент светопропускания. При увеличении содержания ЦИК процент светопропускания снижается. Показатель уровня ЦИК в сыворотке здоровых людей составляет 95-99%

4.Определение уровня комплемента в сыворотке по 50% гемолизу.

Метод основан на прямой зависимости % гемолиза от количества сывороточного комплемента.Эта зависимость точно определена в зоне частичного гемолиза, соответствующего 50% гемолизу.

Интерпретация результатов исследования иммунного статуса.

- должна проводиться с учетом клинических симптомов. При оценке им-

мунного статуса нужно :

1)определить количество всех компонентов иммунной системы;

2)оценить соотношение клеток иммунной системы;

3)оценить функциональную активность клеток.

Возможные варианты оценки иммунного статуса.

1)снижение уровня фагоцитоза - может быть в результате лечения цитостатиками, иммунодепрессантами, лучевой и рентгеновской терапии. Возможна угроза инфекций.

2)повышение уровня фагоцитоза - говорит о нормальном иммунном ответе при остром воспалительном процессе.

3)повышение Ig M - говорит о первичном иммунном ответе при бактериальных, вирусных инфекциях, при опухолях.

4)снижение Ig M - возможно при хронической вирусной инфекции.

5)повышение Ig G - возможно в период реконвалесценции при острой инфекции или в период обострения хронической инфекции.

6)снижение Ig G - говорит о недостаточности гуморального иммунитета, возможна хронизация при острых инфекциях.

7)увеличение Т- и В-лимфоцитов - возможно при остром воспалительном или лимфопролиферативном процессе ( болезни крови ).

Раздел 4. Методики иммунологических исследований

Выделение лимфоцитов в градиенте плотности фиколл-верографина ( d = 1, 077) с одновременным определением Е-РОК и ЕАС-РОК

1. Приготовить забуференный физ. раствор :

10 мл фосфатного буфера с рН = 7,4 + 90 мл физ.раствора ( используется вместо среды Хенкса)

2. Приготовить 0,5 % раствор эритроцитов барана:

9,95 мл забуференного раствора + 50 мкл цельных эритроцитов отмытых 3 раза ( для постановки Е-РОК).

Методику подготовки эритроцитов для постановки ЕАС-РОК см. ниже.

3. Разлить раствор фиколл-верографина по 1,5 мл в центрифужные пробирки.

4. Аккуратно наслоить на 1,5 мл фиколл-верографина неразведенную плазму или разведенную в 2 раза буфером или средой Хенкса кровь.

5. Центрифугировать при 1500 об/мин, 35 мин.

6. После центрифугирования аккуратно собрать белые кольца с границы разделения фаз пастеровской пипеткой с грушей или автоматической пипеткой.

7. Объем полученной суспензии лимфоцитов довести до 10 мл забуфером, отцентрифугировать 7 мин при 1500 об/мин. (для отмывания). К осадку прибавить 1 мл забуфера, тщательно ресуспендировать, после чего объем довести до 10 мл забуфером, отмыть клеточную суспензию 2-й раз.( т.е. снова отцентрифугировать)

8.Затем слить надосадочную жидкость, оставив 1 мл взвеси, ресуспендировать. Разлить в пробирки по 0,2 мл взвеси для определения Т-общих, Т-активных, Т-хелперов, В-лимфоцитов.

Т-общие	Т-активные	Т-хелперы	В-лимфоциты
Смешать 0,2 мл взвеси + 0,2 мл 0,5% эритроцитов барана -Поставить в термостат на 10 мин. Центрифугировать 5 мин. при 1000 об/мин Поставить в холодильник на 30 мин Прибавить 50 мкл 3% глютарового альдегида (экспозиция 5 мин) Прибавить 1 мл дист. воды Центрифугировать 5 мин при 1000 об/мин Надосадочную жидкость слить Сделать мазок из осадка	Смешать 0,2 мл взвеси + 0,2 мл 0,5%эритроцитов барана -Центрифугировать 5 мин. при 1000 об/мин Прибавить 50 мкл 3% глютарового альдегида (экспозиция 5 мин на столе) Прибавить 1 мл дист. воды Центрифугировать 5 мин при 1000 об/мин Сделать мазок из осадка.(20 мкл супернатанта)	Смешать 0,2 мл взвеси + 0,2мл раствора теофиллина(6мг теофил-лина + 3 мл буфера) Поставить на 30 мин в термостат. Прибавить 0,2 мл 0,5% эритроцитов барана Поставить на 5 мин в термостат Центрифугировать 5 мин при 1000 об/мин Поставить в холодильник на 30 мин Прибавить 50 мкл 3% глютарового альдегида (экспозиция 5 мин на столе) Прибавить 1 мл дист. воды (для отмывания) Центрифугировать 5 мин при 1000 об/ мин Приготовить мазок из осадка

Окраска «розеток».

1. Зафиксировать мазки 96 град.спиртом в течении 30 мин.

2. Окрасить в течении 45 мин. смесью краски Романовского и раствора бриллиантовой зелени ( 100 мл краски Романовского + 200 мл дистиллированной воды + 40 мл раствора бриллиантовой зелени)