Аллергические реакции 2 типа - комплемензависимые или цитотоксические.

Эти реакции развиваются при лекарственной болезни, аутоиммунных заболеваниях. Условия их возникновения: аллерген в форме гаптена должен поступать многократно и оседать на поверхности клеток крови /эритроцитов,тромбоцитов, лейкоцитов/. Эти клетки становятся чужеродными- аутоантигенами, на них вырабатываются аутоантитела- Ig G, которые вызывают активацию комплемента по классическому пути. В результате этого в мембране клеток образуются каналы /мембраноатакующие комплексы МАК/, через которые в клетку входит вода и клетка гибнет. В тканях при этом развивается воспаление с преобладанием экссудации/т.е.отека/.

Такой тип аллергии развивается при лекарственной болезни: напр.,на пенициллин- гемолитическая анемия, на сульфаниламиды- агранулоцитоз, тромбоцитопения, местная реакия- отек Квинке.

Аллергические реакции 3 типа- иммунокомплексные.

Эти реакции развиваются тогда, когда в организм поступает много антигена и антител не хватает, чтобы сформировать большие иммунные комплексы /большие иммунные комплексы всегда быстро фагоцитируются/. В организме при этом образуется огромное количество малых иммунных комплек- сов/ЦИК/, которые не успевают фагоцитироваться клетками крови/макрофага-

ми/. ЦИК достигают капилляров, оседают на поверхности эндотелия, капилляры как бы забиваются ими. Здесь же скапливаются фагоциты крови, через 3-6 часов гранулоциты в этом месте погибают, при этом выделяются медиаторы воспаления, развивается перикапиллярное воспаление. В процесс вов- лекаются в первую очередь фильтрующие органы- почки, суставы, а также сердце, кожа. Мозг не страдает, т.к. иммунные комплексы не проходят через гематоэнцефалический барьер. Клинические проявления:сывороточная болезнь- одномоментно в организм поступает много сыворотки, она сохраняется в организме в течение 3-6 месяцев. На нее вырабатываются антитела/аллергены преобладает над антителами, образуются ЦИК,оседающие в со- судах почек, сердца, суставов, кожи.

 Аллергические реакции 4 типа- клеточно-опосредованнные.

Аллерген должен поступать через ткани, богатые вспомогательными нефагоцитирующими клетками/кожу, лимфу, лимфатические узлы, легкие, печень, се- лезенку,тимус/. Эти клетки распознают антиген в комплексе с HLA-D, презентируют антиген Т-эффектору/Т-гзт/, который выделяет медиаторы, дающие следующие эффекты:

1/ лишают ИКК и вспомогательные клетки подвижности;

2/ заставляют пролиферировать лимфоидные и макрофагальные клетки,в результате чего образуется лимфоидно-макрофагальный инфильтрат;

3/ разрушают клетки, несущие антиген, т.е. в инфильтрате появляется некроз, образуется гранулема, т.е. развивается инфильтративно-гранулематозный процесс.

Клинические проявления: инфекционная аллергия при туберкулезе/туберкулема/, сифилисе/гуммы/,бруцеллезе и т.д. Почему это происходит при этих инфекциях? При большинстве бактериальных инфекций имеет место и гуморальный и клеточный иммунный ответ. Но антитела обладают большим сродством к антигену, чем клетки, т.е.чем больше антител , тем менее вы- ражен клеточный иммунный ответ. Но строение возбудителей туберкулеза и сифилиса таково, что идет слабая выработка антител и преобладает клеточный иммунный ответ.

Явление инфекционной аллергии лежит в основе внутрикожных проб, которые используются для диагностики туберкулеза ( проба Манту), бруцеллеза (проба Бюрне), сибирской язвы (проба с антраксином). Если аллерген (напр.,туберкулин) вводится в специфически сенсибилизированный организм (зараженный или вакцинированный), то на месте введения образуется инфильтрат, величина которого зависит от степени сенсибилизации организма и достигает максимума через 48 часов.

Лабораторная диагностика аллергии.

-проводится с учетом механизма аллергических реакций.

Цель: определить тип аллергических реакций и выяснить причину аллергии, т.е. выявить аллерген.

При аллергических реакциях 1 типа:

1/ ставят кожно-аллергические пробы со стандартными аллергенами/ пыль, пыльца, пища, лекарства и т.д./. На месте введения аллергена через 20-30 мин может образоваться покраснение, волдырь!/ а не инфильтрат, т.к. это реакция сосудистого типа, а не клеточного типа, как при РГЗТ/.

2/ выявляют антитела- Ig E, фиксированные на клетках (базофилах, тучных клетках) и содержащиеся в сыворотке.

При аллергических реакциях 2 типа:

выявляют в крови антиэритроцитарные, антилейкоцитарные, антитромбоцитарные антитела/Ig G/.

При аллергических реакциях 3 типа- выявляют ЦИК.

При аллергических реакциях 4 типа:

1/проводят кожные пробы с предполагаемыми аллергенами

2/проводят реакцию бластной трансформации лимфоцитов или реакцию торможения миграции макрофагов.

Лекция 7.

Тема:"Иммунодиагностика инфекционных заболеваний".

План.

1.Классификация иммунохимических методов.

2.Сущность преципитационных методов.

3.Сущность агглютинационных методов.

4.Индикаторные методы.

5.Иммуносенсорные методы.

В диагностике инфекционных заболеваний ведущее значение имеют методы иммунохимического анализа. Их можно разделить на 4 большие группы:

1)прямые методы обнаружения реакции а/г-а/т. Образующийся при этом комплекс выявляется либо визуально, либо с помощью простых оптических приборов. К таким методам относят:

а)реакцию преципитацию в растворе, в геле, на полимерной пленке;

б)реакцию агглютинации бактерий, простейших;

в)реакцию агглютинации эритроцитов антителами, вирусами.

2)непрямые методы обнаружения реакции а/г-а/т. Здесь имеются в виду реакции пассивной агглютинации, т.е.агглютинации частиц, с поверхностью которых связаны а/г или а/т. Такие частицы содержаться в диагностикумах.

К этим методам относят: РНГА, латексагглютинации, коагглютинации, агглютинации желатиновых капсул и т.д.

3)индикаторные методы - в них используются различные метки для выявления реакции а/г -а/т. Это иммуноферментный (ИФА), иммунофлюоресцентный (РИФ), радиоиммунологический анализ (РИА).

4)иммуносенсорные методы - новое направление в иммунодиагностике.

Преципитационные методы.

В результате взаимодействия антигена с антителом образуется преципитат. Реакция проходит в 2 этапа:

1)быстрое взаимодействие а/г с а/т - невидимое глазу;

2)медленное возникновение мультимолекулярных комплексов, включающих в себя огромное число молекул а/г и а/т - визуально восприминимаемое как преципитат.

Механизм реакции объясняется теорией "решетки". Преципитат образуется при соединении одного активного центра 2-х валентного а/т с детерминантой одного антигена, а второго активного центра с детерминантой другого а/г. Избыток или недостаток а/т препятствует проявлению реакции.

Для регистрации плотности преципитата можно использовать турбодиметрию или нефелометрию. Оба метода основаны на явлении рассеивания света частицами преципитата. В области малых концентраций а/г, где имеет место прямая зависимость плотности преципитата от количества а/г, можно вывести формулу связи " концентрация а/г- мутность" и по этой формуле определять неизвестные количества а/г.

Метод преципитации в растворе низкочувствителен, чаще используется метод преципитации в геле. В этом случае молекулы а/г и а/т движутся навстречу друг другу либо за счет диффузии (методы иммунодиффузии), либо за счет электрического поля (методы электрофореза).

При постановке реакции иммунопреципитации в геле возможно визуальное наблюдение преципитата, положение которого в геле совпадает с областью эквивалентности концентраций а/г и а/т. Для полной преципитации необходимо 24-48 часов. В качестве носителя при постановке этой реакции используют агар или агарозу. Методы иммунодиффузии могут быть разделены на 2 группы:

1)в геле диффундирует один компонент иммунного комплекса – одиночная иммунодиффузия

2)диффундируют оба компонента- двойная иммунодиффузия.

Если диффузия идет в одном измерении- то это "линейная иммунодиффузия", если в 2-х направлениях радиально - то это радиальная иммунодиффузия.

Одиночная линейная иммунодиффузия (ОЛИД)

В пробирку с агаром и антисывороткой вносят раствор антигена, образуется полоса преципитата

а/г

а/т

Одиночная радиальная иммунодиффузия (ОРИД) - по Оухтерлони.

А/г диффундирует из круглой лунки в гель, содержащий а/т. Вокруг лунки возникает зона преципитации. Количество антигена в лунке прямо пропорционально площади зоны преципитации.

а/г

 

Двойная линейная иммунодиффузия (ДЛИД)

В трубке, содержащей инертный гель, с 2-х сторон идет диффузия антигена

и антитела.

а/г

преципитат

а/т

 

Двойная радиальная иммунодиффузия (ДРИД) в геле.

А/г и а/т диффундируют навстречу друг другу из 2-х пространственно разделенных лунок. Между лунками возникают полосы преципитации, положение которых совпадает с областью эквивалентности.

а/г1 а/г2 а/г1 а/г2

а/т а/т

эквивалентные антигены различные антигены

Методы иммуноэлектрофореза.

1.Простой иммуноэлектрофорез.

Происходит последовательное разделение многокомпонентного а/г в электрическом поле,а затем эти а/г выявляют с помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии.

+ ---------- а/г---------- -

полиспецифическая сыворотка

2.Встречный иммуноэлектрофорез.

А/г и а/т в геле движутся навстречу друг другу под действием электрического поля.

+ а/г а/т -

преципитат

Прямые агглютинационные методы.

В практике применяются 2 типа реакций:

1)реакция агглютинации живых или убитых бактерий или паразитов антителами;

2)реакция агглютинации эритроцитов вирусами или бактериями.

Эти реакции могут использоваться в 2-х направлениях:для сероидентификации и для серодиагностики.

Сероидентификация.

Реакции 1 типа применяются для идентификации возбудителя - определения серотипов эшерихий, сальмонелл, шигелл, клебсиелл, стрептококков, пневмококков и т.д.

Реакции 2 типа применяются для идентификации вирусов гриппа, парагриппа, кори, краснухи .Этот метод основан не на реакции а/г-а/т, а на взаимодействии особых белков вирусов (гемагглютининов) с поверхностными а/г эритроцитов.

Серодиагностика.

Для обнаружения антител в крови больного используют 2 разновидности реакций:

1)реакция прямой агглютинации, напр., реакция Видаля, реакция Райта.

2)реакция торможения прямой агглютинации вирусами (РТГА)- для диагностики кори, краснухи, эпидемического паротита, парагриппа и т.д.

При постановке этой реакции исследуемый материал соединяют с противовирусной сывороткой и помещают в термостат на 30 мин., затем прибавляют эритроциты. Специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом, нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации. Положительная реакция будет проявляться отсутствием агглютинации (пуговка), отрицательная реакция - наличие агглютинации (зонтик).

Методы прямой агглютинации менее чувствительны, но более дешевы.

При всех этих реакциях определение антител возможно лишь после нескольких дней болезни ( 5-7 и более), когда сформируется выраженный гуморальный ответ.

Методы непрямой или пассивной агглютинации.

Принцип: получают специального типа частицы , на поверхности которых находятся молекулы известной специфичности- а/г или а/т. При наличии в исследуемом материале соответствующих а/т или а/г эти частицы образуют хлопьевидный осадок. Его можно обнаружить в капле жидкости на стекле или на дне лунок агглютинат равномерно покрывает дно в виде "зонтика", а непрореагировавшие частицы скатываются в центр, образуя "пуговку".

В практике используются 3 типа пассивной агглютинации:

1)РПГА- используются сенсибилизированные эритроциты (диагностикумы)

2)реакция коагглютинации- используются клетки золотистого стафилококка.

3)реакция латексагглютинации- используются полимерные микрошарики латекса.

Реакции 2 и 3 типа просты в исполнении и могут проводится в полевых условиях.

Индикаторные методы.

Радиоиммунологический анализ.(Р И А)

Сущность: иммунный комплекс определяется с помощью радиоактивной метки, введенной в состав а/т или а/г. Особенно широко применяются 2 разновидности Р И А:

1)РИП - радиоиммунопреципитация

2)ТФРИА - твердофазный радиоиммунологический анализ.

В качестве радиоактивной метки используют -изотопы: водород 3 и углерод 14 и -изотопы:иод 125 и иод 131.

1) РИП - в растворе формируется радиоактивный иммунный комплекс, а затем он отделяется от не вошедших в него макромолекул с помощью метода "двойных" антител. Комплекс а/г-а/т утяжеляется путем взаимодействия его с антивидовыми Ig , специфичными к а/т, вошедшим в иммунный комплекс. После формирования вторичного иммунного комплекса преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. Затем количественно определяют радиоактивный компонент преципитата с помощью счетчиков радиоактивности , либо ауторадиографией.

вторичные а/т вторичные а/т

меченое а/т немеченное а/т

а/г меченный а/г

(немеченный а/г + меченное а/т) (меченный а/г + немеченное антитело)

2) Т Ф Р И А- а/г или а/т изначально адсорбируются на пластинах адсорбента, т.е. иммунная реакция проходит не в растворе, а на твердой фазе. На иммобилизированный а/г или а/т последовательно сорбируются остальные компоненты иммунного комплекса. Преимущество метода в том, что можно удалять из реакционной смеси не вошедшие в иммунный комплекс макромолекулы путем простой промывки.

а/т а/т

а/т

а/г

а/т

а/г

а/г а/т

простой "сэндвич" модифицированный "сэндвич" двойной "сэндвич"

Иммунофлюоресцентные методы.

В основе этих методов лежит использование а/г или а/т, в состав которых введены флуоресцентные метки. О наличии иммунного комплекса судят по интенсивности флуоресценции системы. В качестве флуоресцирующих меток используют флюорохромы: ФИТЦ, родамин, порфирин, хлорофиллы и т.д.

Существуют следующие варианты иммунофлюоресцентного метода:

1)твердофазные - метод иммунофлюоресцентной микроскопии. А/г или а/т ад- сорбируются на покровном стекле. Затем при  прямом  методе используются меченные флюорохромами а/г или а/т. Тогда на месте, куда наносится индикаторный конъюгат, возникает флюоресценция. При непрямом  .методе а/г и а/т не метятся: на стекло наносят исследуемый материал, промывают и наносят а/т к этому а/г, снова промывают и наносят антивидовые, меченные флюоресцентной меткой а/т ( метод иммунного "сэндвича").

Иммуноферментный анализ ( ИФА ).

В качестве индикаторной молекулы при этом методе используется молекула фермента ( чаще пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). ИФА является более чувствительным методом по сравнению с РИА или РИФ.

Различают 2 варианта ИФА:

1) гомогенный

2) гетерогенный (твердофазный).

1) Гомогенный ИФА - наиболее простой метод. А/г метится ферментом, после соединения а/г с а/т изменяется активность фермента, что определяют по изменению цвета.

Преимущества метода:

1)метод занимает минуты или доли минуты

2)имеет одну стадию и не нужна промывка

3)не требует больших объемов исследуемого материала ( достаточно 8-50 мкл ).

Недостаток: тест-системы созданы только для низкомолекулярных а/г, поэтому этот метод используется для выявления гормонов, пептидов, лекарственных веществ.

2) Гетерогенный ИФА  ( твердофазный )- ТФИФА или ELISA - один из участников реакции а/г- а/т иммобилизуется на твердом носителе (полистироловые пластины). Принцип метода такой же, как при твердофазном РИА.

Иммуносенсорный метод.

Иммуносенсоры - это приборы с полимерной мембраной. При оседании на их поверхности иммунных комплексов изменяется заряд мембраны и ее поверхностный потенциал, что определяется электродом или оптическим устройством.

Существует 2 типа иммуносенсоров:

1)немеченный иммуносенсор. Состоит из немеченного электрода, покрытого полупроницаемой полимерной мембраной с иммобилизованными на ней молекулами а/т или а/г.

2)меченный иммуносенсор. На мембране также иммобилизируются а/г или а/т, меченные ферментом каталазой, но реакция определяется по изменению проводимости.

Впервые иммуносенсоры были применены при диагностике сифилиса: на полупроницаемой мембране электрода связывали а/г трепонемы и инкубировали его в растворе сыворотки крови. По изменению разницы потенциалов судили о концентрации а/т в крови.

Преимущества метода: после отмывания иммуносенсор можно использовать вновь. Также можно определяют HBs Ag, глюкозу в крови, гормоны.

Лекция 8.

Тема: " Оценка иммунного статуса".

План.

1.Определение понятия иммунный статус.

2.Варианты иммунного статуса при патологических состояниях.

3.Этапы исследования иммунного статуса.

4.Тесты 1-го уровня.

Иммунный статус человека - это совокупность лабораторных показателей, характеризующих количество и функциональную активность клеток иммунной системы. Под нормальным состоянием иммунного статуса подразумевают показатели иммунной системы у практически здоровых лиц разных возрастных групп. Параметры иммунной системы при патологических состояниях можно разделить на 3 группы:

1) без существенных изменений в иммунном статусе

2) с недостаточностью иммунной системы (иммунодефициты)

3) с гиперактивацией ИКК (аллергия, аутоиммунные заболевания)

Считается, что снижение показателей иммунного статуса указывает на иммунодефицит. Если определяют отклонение только в Т-клеточном звене, то это иммунодефицит клеточного иммунитета. Если определяют отклонение только в В-клеточном звене, то это иммунодефицит гуморального иммунитета. Если снижены показатели в обоих звеньях, то это комбинированный иммунодефицит.

Труднее интерпретировать повышенные показатели, т.к. их повышение (напр., повышение количества Т- и В-лимфоцитов, продукции Ig, повышение фагоцитарной активности и т.д.) может быть не столько отражением реакции на собственные клетки и ткани (аутоиммунитет), сколько реакцией против чужеродных агентов, проникающих в организм извне (микробы, белки, химические соединения) или реакцией на любые повреждения организма - механические, термические, радиационные, токсикозы, геморрагии, тромбозы.

При повреждениях иммунокомпетентные клетки участвуют в отграничении пораженной области от здоровой и в удалении поврежденных клеток. Т.о. оценка иммунного статуса - дело трудное!!!

В настоящее время используется 2-х этапная система оценки иммунного статуса. На первом этапе выявляются грубые дефекты в клеточном и гуморальном иммунитете.

Это позволяют сделать тесты 1-го уровня. К ним относятся следующие методы :

1)определение относительного и абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови;

2)тесты Е- и ЕАС-розеткообразования для определения относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов;

3)определение концентрации сывороточных Ig основных классов (IgM, Ig A, Ig G );

4)определение фагоцитарной активности лейкоцитов.

На втором этапе определяются тесты второго уровня. Они позволяют

уточнить характер выявленного дефекта. К ним относятся следующие тесты:

1)определение субпопуляций Т-лимфоцитов;

2)определение функциональной активности ИКК с учетом их стадий активации;

3)определение медиаторов иммунной системы;

4)выявление иммунных комплексов, компонентов системы комплемента и т.д.

Тесты 1 уровня.

Схема забора крови на иммунологические исследования.

клеточный иммунитет мазок на фагоцитоз

c цитратом натрия

или с гепарином центрифугируют

кровь из вены

получение клеточной

суспензии

на фиколл- на желатине

верографине

гуморальный иммунитет

определение Т- и В-лимфо-

цитов с помощью Е-РОК и

ЕАС-РОК или на проточном

цитофлюориметре.

без цитрата натрия

центрифугирование или отстаивание сыворотка

определение Ig