Определение степени токсичности исследуемого корма

Степень токсичности корма	Количество погибших гуппий	Время гибели
Слабо токсичный Нетоксичный Токсичный	Не более 2 – 4 5	В течение 24 час. В течение 24 час. В течение 24 час.

В качестве контроля используют 1%-ный раствор ацетона, в котором

гупии в течение суток должны оставаться живыми. Контроль ставят с целью определения качества ацетона.

Определение токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикорма по кожной пробе на кроликах.В банку или колбу с притертой пробкой на 500 мл помещают 50 г измельченного корма, заливают 150 мл эфира и экстрагируют 24 часа, периодически встряхивая, или экстрагируют 3 часа на шуттель- аппарате. Если слой экстрагента над пробкой будет менее 1 см, объём его увеличивают. После экстракции жидкость фильтруют через бумажный фильтр в выпаривательную чашку. Оставшуюся в колбе или в банке пробу корма дополнительно промывают небольшой порцией эфира (не менее 2 мл), промытую порцию фильтруют через тот же фильтр. Растворитель выпаривают до полного исчезновения запаха, для ускорения этого процесса используют водяную баню. Экстракт, оставшийся на стенках чашки, смывают эфиром для того, чтобы основное количество его находилось на дне чашки. Все операции, с использованием эфира, проводят в вытяжном шкафу. Полученный экстракт должен иметь консистенцию растительного масла желтоватого или коричневого оттенка. Если экстракт имеет восковидную консистенцию, его подогревают непосредственно перед нанесением на кожу кролика.

На выстриженный участок кожи кролика стеклянной лопаточкой наносят, слегка втирая, половину экстракта. Небольшую часть оголённого участка кожи оставляют свободной от экстракта. Если экстракта недостаточно для двух нанесений, его предварительно разбавляют подсолнечным маслом так, чтобы общее количество его составило не менее 1 г. На шею кролика одевают воротник из фанеры, оргстекла или другого материала размером 16*20 см для предупреждения слизывания экстракта с кожи.

О токсичности зерна, продуктов его переработки и комбикорма судят по развитию воспалительной реакции на коже кролика. Исследуемый материал считается нетоксичным при отсутствии воспалительной реакции или наличии гиперемии, сохраняющейся более 2 суток после нанесения экстракта и не сопровождающихся шелушением кожи.

Зерно, продукты его переработки и комбикорма слаботоксичные, если после нанесения экстракта гиперемия сохраняется 2-3 суток и заканчивается шелушением кожи, болезненностью и отечностью, проявляющимися значительным утолщением кожи с последующим образованием отдельных корочек.

Зерно, продукты его переработки и комбикорма токсичны, когда имеется резкая гиперемия, болезненность, складчатость, отёк, проявляющимися сильным утолщением кожи; на всей поверхности появляются язвы, затем сплошной струп.

Контрольные вопросы:

1 Дайте определение микозам и микотоксикозам?

2 Какие условия способствуют развитию микозов и микотоксикозов?

3 При каких условиях представляет токсикологическую опасность свекла, кар

тофель, кукуруза, льняной, хлопковый жмыхи?

4 Назовите пути профилактики отравления растительными ядами?

Тема: Токсикологический анализ при отравлениях алкалоидами

Цель занятия: Изучить методы определения алкалоидов.

Методы определения алкалоидов. Исследование на ал­калоиды основано на реакции осаждения их и образо­вании солей алкалоидов с кислотами. Некоторые алка­лоиды образуют осадки, растворимые в избытке реак­тива. Для выделения алкалоидов из растений и патоло­гического материала пользуются растворимостью кислых и виннокислых солей алкалоидов в 90° спирте, подкис­ленном винной кислотой.

Реактивы: 1 5%-ный водный раствор танина.

2 1%-ный водный раствор пикриновой кислоты.

3 5%-нын водный раствор сулемы (HgCb).

4 Раствор Люголя .

5 Реактив Мейера.

6 Реактив Драгендорфа.

7 Реактив Фреде.

8 Реактив Марки.

9 Реактив Менделина.

10 Реактив Эрдмана

Извлечение алкалоидов. В колбу помещают 10 г су­хих растений, превращенных в мелкий порошок, и сме­шивают с 1%-ным раствором уксусной кислоты (можно с, 1%-ным раствором винной или щавелевой и другими слабыми кислотами). Смешивание производят из рас­чета 1 : 10, т. е. одна часть растения и 10 частей кис­лоты. Колбу помещают в кипящую водяную баню и на­гревают до кипения, периодически 'взбалтывая. После водяной бани охлаждают, взбалтывая в течение 15 ми­нут, фильтруют через складчатый фильтр. В полученном фильтрате определяют наличие алкалоидов следующим образом.

На часовое стекло наносят каплю фильтрата и рядом каплю (меньшую по размеру) реактива на алкалоиды. Капли смешивают стеклянной палочкой. Для этой цели требуются 3—4 реактива, так как многие алкалоиды по-разному относятся к алкалоидным реактивам. Поэтому берут несколько часовых стекол, т. е. столько, сколько имеется реактивов. При наличии алкалоидов на часовом стекле после смешивания фильтрата с реактивом обра зуется осадок или муть разной окраски и консистенции. При отсутствии осадка или мути, что имеет значение как фактор, исключающий наличие алкалоидов, смесь реактива с извлечением остается прозрачной.

Определение алкалоидов при помощи индикаторной бумаги (по В. М. Серову). Метод основан на окрашивании индикаторной бумаги при на­личии алкалоидов.

Реактивы. 1 2%-ный водный раствор йодида калия.

2 10%-ный водный раствор платннохлористоводородой ки-

слоты.

3 Полоски хроматографической или фильтровальной бумаги, размером 3X7 см, пропитанные до половины смесью реактивов № 1 и № 2. Пропитывание производят смесью растворов: 1 мл йодида калия + 0,1 мл раствора платинохлористоводородной кислоты. Смесь платинохлористоводородной кислоты с йодидом калия нестойка, тогда как пропитанная и высушенная хроматографическая бумага сохраняет свою активность в течение месяца в склянке из темного стекла.

При исследовании окрашенную часть полоски инди­каторной бумаги разделяют простым карандашом на че­тыре равные части: на первой части пишут цифру 1, на второй —3 и далее 5 и 15. Указанные цифры соответ­ствуют количеству капель исследуемой вытяжки, нано­симой на указанный участок. На чистом конце хромато­графической бумаги пишут номер экспертизы, дату и объект исследования. Исследуемую вытяжку каплями с интервалами во времени (очередная капля наносится после испарения предыдущей) наносят на определенный участок индикаторной бумаги. При наличии алкалоидов на красном фоне индикаторной бумаги появляются цвет­ные пятна. Если содержание алкалоидов велико, то цвет­53ИИ пятно появляется после нанесения первой капли исследуемой хлороформенной вытяжки.

При сомнительных данных индикаторную бумагу сле­дует отмывать дистиллированной водой в течение 2— 5 минут. Если алкалоид образовал красное пятно, кото­рое было слабо видно на общем красном фоне, то крас­ный цвет индикаторной бумаги исчезнет, а окрашенное красное пятно йодплатината алкалоида останется на бе­лом фоне индикаторной бумаги. Чувствительность этого метода в пределах 1 : 10 000—1 : 100 000.

Идентификация алкалоидов методом хроматографии.Метод хроматографии основан на различии коэффициентов распределения исследуемых веществ между двумя несмешивающимися жидкими фа­зами. Неподвижной фазой является вода 53ИИ53вляя53афии ческой бумаги, а для подвижной фазы применяется Н-бутиловый спирт. Вместо Н-бутилового спирта можно применять пропиловый спирт, толуол, ацетон, бензол.

Реактивы. 1 Полоски.хроматографической или фильтроваль­ной бумаги размером 20X40 см.

2 Н-бутиловый спирт: 40 мл спирта + 60 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты или 100 мл спирта + 50 мл 20%-ного раствора ледяной уксус ной кислоты.

3 Реактив Драгендорфа; приготовляют два раствора: раствор А — 0,85 г основного нитрата висмута растворяют в 50 мл 25%-ного раствора уксусной кислоты; раствор Б —8 г йодистого калия растворяют в 20 мл дистиллированной воды.

Рабочий раствор готовят перед употреблением, для этого берут 120 мл 25%-ного раствора уксусной кислоты и в него добавляют 5 мл раствора А и 5 мл раствора Б.

Исследование проводят следующим образом. Хлоро форменной вытяжке, давшей положительную групповую реакцию на алкалоиды по индикаторной бумаге (стр. 182), -дают самоиспариться до густоты сиропа. Затем при по­мощи микропипетки 0,02 мл сиропа наносят на хрома-тографическую бумагу и оставляют до полного высыха­ния. Линия нанесения исследуемой вытяжки должна быть с интервалами 2—2,5 см, от нижнего края хромато­графической бумаги — на расстоянии 5—6 см и от боко­вого края —2 см. Как только исследуемый раствор вы­сохнет, хроматографическую бумагу помещают в сосуд вертикально, так, чтобы нижний край ее касался реак­тива № 2, который предварительно помещен в этот со­суд. Образовавшиеся пятна на бумаге после высыхания исследуемой вытяжки должны находиться от уровня ре­актива № 2 на расстоянии 3 см.

После закрепления хроматографической бумаги в со­суде реактив № 2 начнет подниматься по ней вверх, увлекая за собой соли алкалоидов. Скорость продвиже­ния солей алкалоидов по хроматографической бумаге различна, в результате чего происходит перераспределе­ние алкалоидов. Как только линия продвижения реак­тива № 2 достигнет высоты 30—40 см (для чего потре­буется от 12 до 48 часов), каждый алкалоид будет зани­мать подходящую для данного исследования высоту на хроматографической бумаге. После этого хроматографи­ческую бумагу извлекают из сосуда, отмечают простым карандашом линию, которой достиг реактив № 2, и вы­сушивают в потоке горячего воздуха. Высушенную бу­магу предварительно исследуют в ультрафиолетовых лучах, выдерживают в парах йода или обрабатывают реактивом № 3. При этом пятна различной окраски (красные, оранжевые, бледно-оранжевые и др.), образо­вавшиеся на бумаге, обводят простым карандашом и сравнивают с хроматограммами, полученными в анало­гичных условиях из ядовитых растений. Сравнение пятен производят с учетом окраски и места нахождения их на бумаге (расстояние от нижней границы реактива № 2). При сравнении делают заключение о наличии того или иного алкалоида.

Определение никотина биологическим методом. Лягушке вводят под кожу препарат нико­тина (яд различных видов табака), помещают се под стеклянный колпак и наблюдают постепенное развитие угнетения центральной нервной системы, которое обус­ловливает лягушке характерное (никотинное) положение. При сидячем положении передние ноги прижаты к жи­воту, в то же время задние конечности располагаются под прямым углом к позвоночнику, голени судорожно по­догнуты к бедрам. Если голени оттянуть, они вновь при­мут прежнее положение. При этом наблюдается ригид­ность передних лап.

Контрольные вопросы:

1 Извлечение алкалоидов?

2 Определение алкалоидов при помощи индикаторной бумаги?

3 Идентификация алкалоидов методом хроматографии?

4 Определение алкалоидов никотина биологическим методом?

Тема: Токсикологический анализ при отравлениях сапонинами

Цель занятия: Изучить методы определения сапононов в растения и кормах.

Методы определения сапонинов в растениях и кормах

Качественная проба. Гемолитическая проба. Проба основана на гемолизе эритроцитов.

Реактивы. 1 Физиологический раствор хлористого натрия: 9 г хлористого натрия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды.

2 5%-ная взвесь эритроцитов.

Кровь берут из яремной вены любого животного в стеклянный стаканчик, дефибринируют ее круговым помешиванием деревянной палочкой в течение 10—^минут. Фибрин с палочкой удаляют, а плазму с эритроци­тами дефибринированной крови фильтруют через 2 слоя марли. Фильтрат смешивают с 2—3 объемами физиологи­ческого раствора поваренной соли и производят центри­фугирование в течение 8—10 минут. Во время центри­фугирования эритроциты оседают на дно пробирки, а сверху остается слегка окрашенная в розовый цвет жидкость. Затем прозрачную розовую жидкость осторожно отсасывают, стараясь не задевать слоя эритроци­тов, после чего к нему доливают до первоначального уровня физиологический раствор поваренной соли и снова центрифугируют. Если после второго промывания жидкость над эритроцитами стала бесцветной и прозрач­ной, то на этом заканчивают промывку эритроцитов, в противном случае промывку повторяют третий раз. За­тем берут 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов и к ним добавляют 9,5 мл физиологического раствора.

Исследование материала проводят следующим обра­зом. В колбочку помещают 1 г измельченного, сена или муки, или отрубей и добавляют 10 мл физиологического раствора поваренной соли, измельченное сено ставят на 10 минут в кипящую водяную баню (при частом поме­шивании), а муку или отруби экстрагируют 15 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая. После этого фильтруют через бумажный фильтр. Полу­ченный фильтрат в количестве 2 мл помещают в про­бирку. Такое же количество физиологического раствора хлористого натрия наливают в другую пробирку. Затем добавляют по 0,5 мл 5%-ной взвеси эритроцитов в обе пробирки, встряхивают и оставляют их в штативе. Че­рез 5—10 минут учитывают результат. При наличии са­понинов в исследуемом извлечении (первая пробирка) наступит гемолиз эритроцитов, тогда как в контрольной (второй) пробирке гемолиза не будет

Контрольные вопросы:

1 Приготовления 5%-ой взвеси эритроцитов?

2 Определение сапонинов качественной пробой?

Тема: Токсикологический анализ при отравлениях гликозидами

Цель занятия: Освоить метод определения гликозидов на лягушке.

Биологический метод определения гликозидов. Метод основан на способности гликозидов вызывать систолическую остановку сердца животных.

Предварительно готовят извлечение – отвар или настой. Для этого в колбочку или фарфоровую инфундирку помещают 3-5 г тонко измельченного растения, добавляют 30-50 мл холодной дистиллированной воды, закрывают крышкой и нагревают в течение 35 минут, настой-15 минут. По истечении этого срока отвары фильтруют горячими, а настой - после охлаждения.

Определение проводится на лягушках с обнаженным сердцем. Для удобства инъекции испытуемого препарата и дальнейшего наблюдения за действием его, лягушку накалывают на пробковую пластинку брюшком вверх. Булавки вкалывают в перепонки между пальцами верхних и нижних конечностей, лапки вытягивают в соответствующие стороны, с тем чтобы лишить лягушку возможности произвольных движений, после чего приступают к обнаружению сердца. Для этого с тонким пинцетом захватывают кожу на груди между верхними конечностями и вырезают треугольное отверстие. Вырезанный лоскут не должен быть велик. Общие размеры отверстия должны быть таковы, чтобы выведенное в дальнейшем сердце свободно помещалось на лишенном кожу участке и не прикасалось к наружной стороне последней. Это необходимо потому, что выделяемый кожей секрет способен действовать отравляющим образом на сердечную мышцу лягушки.

Затем удаляют ножницами хрящевую часть грудины с мускулатурой, нарушают целостность сердечной сорочки, легким надавливанием пальца на брюшную стенку по направлению к голове выталкивают сердце в образовавшееся отверстие. После обнаружения сердца лягушкн вводят по 0,3 мл исследуемого отвара или настоя в лимфатические бедренные мешки. Для этого оттягивают кожу пинцетом на грудной поверхности и через треугольное отверстие, лишенное кожи, вводят тонкой длинной иглой исследуемый препарат. Наблюдение ведут в течение 60 минут. При наличии гликозидов произойдет остановка сердца в стадии систолы, т.е. сердце будет максимально сокращено и бледно окрашено.

Контрольные вопросы:

1 Как готовят отвар или настой?

2 Определение гликозидов на лягушке?

Тема: Токсикологический анализ при отравлениях соланином

Цель занятия: Освоить методы определение соланинов.

Методы определение солонина

Качественная проба. Проба основана на цветной реакции в результате взаимодействия солонина с реактивами. С клубня картофеля делают несколько срезов толщиной около миллиметра:

1 от верхушки до основания по оси, делящей клубень на две равные половины;

2 поперечные – у основания и верхушки клубня;

3 с боков клубня;

4 в участках около глазков;

Срезы раскладывают по фарфоровой чашке или на часовом стекле. На срезы наносят по каплям вначале уксусную кислоту, затем серную кислоту и, наконец несколько капель перекиси водорода. При наличии соланина почти немедленно появляется резкое темно-малиновое или красное окрашивание. При отсутствии окрашивания или появления бугровой окраски реакция отрицательная. Моча животных, отравленных соланином, суживает зрачок у кошки.

Количественное определение. Содержание соланина в различных частях картофеля колеблется (в процентах): в клубнях от 0,002 до 0,004, в шелухе от 0,005 до 0,01, в зеленой ботве от 0,05 до 0,25, в цветах от 0,6 до 0,7, в ягодах до 1, в картофеле с зеленой кожурой до 0,5.

Количественное определение основано на извлечении и осаждении соланина из исследуемого материала.

Для исследования берут 300г картофеля, измельченного на терке. К полученной массе прибавляют 250 мл дистиллированной воды и настаивают при комнатной температуре в течение 30 минут, периодически помешивая. Затем жидкую кашицу переносят в плотный льняной мешочек и хорошо отжимают под прессом. Выжимки трижды обрабатывают 0,2%-ным раствором уксусной кислоты (по 250-300 мл) и после каждой обработки снова отжимают под прессом.

Всю отжатую жидкость собирают в фарфоровую чашку, подщелачивают аммиаком до слабощелочной реакции, добавляют 10 г инфузорной земли и выпаривают на водяной бане досуха. При выпаривании появляющуюся на краях чашки коричневую массу периодически смывают выпариваемой жидкостью и небольшим количеством теплой дистиллированной воды. Полученный порошок помещают в колбу, снабженную обратным холодильником, добавляют 125 мл 95⁰ спирта и 30 минут кипятят в водяной бане. Прибор после охлаждения разбирают и содержимое фильтруют. Осадок помещают обратно в колбу, затем добавляют 125 мл свежей порции спирта и кипятят (операцию повторяют 4 раза). Спиртовые вытяжки собирают в колбу, из которой отгоняют спирт. К полученному остатку добавляют 100 мл дистиллированной воды, подкисленной 5 каплями уксусной кислоты, смешивают и фильтруют. К фильтрату прибавляют аммиак до слабощелочной реакции, после чего нагревают 30 минут на кипящей водяной бане.

При наличии соланина образуются хлопья, которые отфильтровывают и промывают 2,5%-ным раствором аммиака. Полученный осадок окрашивается в слабо-коричневый цвет. Для получения чистого соланина осадок растворяют в 30 мл теплого спирта, фильтруют, спирт выпаривают на водяной бане. Остаток растворяют в 100 мл дистиллированной воды, подкисленной уксусной кислотой (5-8 капель), и снова осаждают аммиаком.

Такую очистку повторяют 2-3 раза.

Белый осадок соланина, собранный на предварительно взвешенный фильтр, сушат при температуре 100⁰ до постоянного веса.

При количественном определении необходимо учитывать , что при осаждении соланина аммиаком в 100мл аммиака остается 2,75 мг соланина.

Пример. После высушивания исследуемого материала получено 665 мг соланина и израсходовано 200 мл аммиака на осаждение. Тогда содержание соланина (в мг %) составит:

665+5,5х100

300

Определение соланина в высушенной и мелко измельченной ботве картофеля и силосе производится аналогично. В патологоанатомическом материале из трупов животных соланин обнаружить не удается.

2. Навеску 50г сухого, тонко измельченного клубня (или ботвы) картофеля помещают в колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 150 мл этилового спирта и кипятят 30 минут при частом взбалтывании.

Охлажденный экстракт фильтруют через воронку Бюхнера и бунзеновскую колбу. Остаток вновь подвергают экстрагированию спиртом (по 100-150 мл). Извлечение спиртом повторяют 4 раза. Все полученные спиртовые экстракты соединяют вместе. Спирт отгоняют на водяной бане. К почти сухому остатку добавляют 150 мл дистиллированной воды, подкисленной уксусной кислотой.

Полученный мутный раствор центрифугируют. Верхний слой сливают, а в остаток добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты и опять центрифугируют; промывание повторяют 2 раза. Полученные промывные воды соединяют с первой вытяжкой и постепенно приливают 5%-ный раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус. После этого нагревают 30 минут на кипящей водяной бане. Если во время нагревания весь аммиак улетучится, его добавляют. При нагревании выпадает хлопьевидный осадок соланина. Осадок солонина центрифугируют. Затем его растворяют в спирте, спирт отгоняют. Остаток растворяют в воде, подкисленной уксусной кислотой , и после центрифугирования осаждают аммиаком.

Такую очистку повторяют 2-3 раза. Последний раз соланин фильтруют через бумажный фильтр, предварительно взвешенный. Осадок на фильтре промывают 1%-ным раствором аммиака и высушивают при температуре 100⁰ до постоянного веса. Вес полученного соланина во взятой навеске пересчитывают на процентное содержание.

Контрольные вопросы:

1 Качественное определение соланины?

2 Количественное определение соланины?

Тема: Токсикологический анализ при отравлениях госсиполом

Цель занятия: Освоить методы определения госсипола в хлопчатниковом жмыхе, печене, моче.