Лабораторная работа № 3 Способы окрашивания микроорганизмов. Определение основных форм бактерий

Учебная цель работы: ознакомиться с основными способами окрашивания микроорганизмов, научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты. Ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение:

1. Культуры микроорганизмов.

2. Набор красок для окрашивания по Граму.

3. Бак. петли.

4. Спиртовки.

5. Предметные стекла.

6. Фильтровальная бумага

7. Кедровое масло.

8. Микроскопы.

9. Набор сухих красок (для демонстрации студентам)

Организация и методика выполнения работы

Для изучения формы микробной клетки и некоторых ее структур исследуемый вид микроба окрашивают.

Наиболее часто употребляемые краски: фуксин основной, (цвет раствора ярко - красный), сафрананин (цвет раствора красный), метиленовый синий (цвет раствора синий) кристаллвиолет (цвет раствора фиолетовый), малахитовая и бриллиантовая зелень (цвет раствора интенсивно зеленый), фуксин кислый (цвет раствора красный), пикрин кислый (цвет раствора интенсивно желтый).

Различают простой и сложный метод окрашивания.

При простом методе окрашивания используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовой синий.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ.

На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка Фуксином Пфейффера красят 1-2 мин. метиленовым синим 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

Окраска по Граму.

Сложные методы окраски применяют с целью диагностики выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом.

Сущность окраски заключается в том, что при обработке генциан -виолетом и йодом в клетках одних м.о. образуется относительно устойчивый нерастворимый комплекс. Эти м.о. относятся к грамположительным. Клетки других м.о. после обработки генциан- виолетом и йодом легко обесцвечиваются спиртом и приобретают красный цвет при последующей окраски фуксином . Их считают грамотрицательными . Способность клеток окрашиваться по Граму зависит от ряда причин и прежде всего от возраста культуры. Некоторые бактерии, будучи грамположительными в молодых культурах, в старых -неодинаково интенсивно красятся по Граму Поэт ому красить по Граму всегда следует клетки молодых (чаще всего односуточных) культур . Одновременно целесообразно окрашивать клетки контрольных м.о. .отношение которых к окраске по Граму заранее известно . Мазок дня окраски по Граму . должен быть тонким, чтобы клетки равномерно распределялись на поверхности предметного стекля и не образовывали скоплений так как от толщины мазка зависят результаты окрашивания.

Окраску по Граму проводят следующим образом : На 1 обезжиренном предметном стекле готовят три мазка из разных культур В центре наносят мазок исследуемого микроорганизма. Слева и справа мазки контрольных микроорганизмов. Клетки одного из контрольных м.о. окрашивают по Граму положительно (например, одни из представителей рода Sarcina.)., а клетки другого - по Граму не окрашивают (например Esherichia colt). Мазок высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Фиксация хим. соединениями не рекомендуется. На фиксированный мазок наливают р-р карболового генпнан-внолетя . мазок окрашивают в течении 1-2 мни. Краситель смыввают и не промывают препарат водой, обрабатывают его раствором Люголя в течении 1-2 мин. этиловым спиртом 96% для обесцвечивания .С этой целью помещают предметное стекло 2-3 раза в стакан с 96% этиловым спиртом или наливают спирт на мазок. В последнем случае мазок слегка покачивают, и спирт меняют несколько раз. Чтобы исключить излишнее обесцвечивание клеток, к спирту следует добавить йод (2 мл. 10% спиртового раствора йода на 100 мл. этанола). Препарат промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином в течение 1-2 мин. Краситель сливают , препарат вновь промывают водой , высушивают и микроскопируют иммерсионной системой . При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный цвет фуксина

Определение основных форм бактерий.

Знакомство с основными формами бактерий проводится на примере следующих представителей.

Бактерии шаровидные - кокки ( греч. coccus - зерно, шарик.) делятся на следующие группы;

Микрококки: В природе встречаются в виде одиночных шаровидных клеток. В качестве примера можно взять клетки Micrococcus agilis (micro -маленький. agilis - подвижный.)

Диплококки (diploos - двойной) - шаровидные бактерии, соединенные по 2 клетки. К диплококкам относятся Azotobacter chrococcum. Родовое название отражает ею физиологическую функцию - фиксирование азота атмосферы, видовое - способность продуцировать коричневый пигмент (Спою - коричневеющий), и шаровидную форму (соссит).

Стрептококки (streptos – цепь) - шаровидные бактерии, образующие в результате деления клеток в одной плоскости разнообразной длины цепочки. С этими бактериями знакомятся при изучении молочнокислого брожения на примере Streptococcus Lactis .Родовое название отражает характер расположения шаровидных клеток в виде цепочки, видовое - причастность стрептококка к молочнокислому брожению (lactis -молочный).

Сарцины - (sarceo - соеднн.) шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток. Располагаются они в виде куба с каждой стороны которого по 4 клетки. Такая форма возникает в результате деления клетки в 3 взаимно перпендикулярных плоскостях. Некоторые виды сарцин формируют большие сарциноподобные кубообразные пакеты, но уже с каждой стороны находятся не I клетки (субьединицы сарцины), а по 4 сарцины.

Удобна для просмотра Sarcina Flava (сарцина желтая) - наиболее типичный представитель флоры воздуха.

Все шаровидные формы бактерий, за исключением Streptococcus lactis просматриваются на фиксированном и окрашенных препаратах фуксином.

Бактерии палочковидные делятся на 2 группы- бациллы и бактерии. Бациллы образуют споры, бактерии их не образуют (роды Bacterium, Achoromobacter, Flavobacteriun и др.) К бактериям принадлежат: Pseudomonas stutzeri, относящаяся к денитрифнкаторам. Поскольку это неспорообразующая крашеный препарат из зубного налета. Особенно удачны препараты, если взять соскоб с кариесного зуба. Зубные спирохеты чрезвычайно тонкие, почти волосовидные.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ:

1. Какие методы окраски микробов различают?

2. Методика окраски препарата простым методом?

3. Рассказать методику окраски микробов по Граму.

4. Назвать м.о. красящих по Граму положительно?

5. Назвать м.о красящих по Граму отрицательно.

6. Перечислите наиболее часто употребляемые краски.

7. Сущность окраски по Граму.

8. Классификация одноклеточных бактерий по форме.

9. По какому признаку классифицируется шаровидные м.о ?

10. По какому⁷ признаку классифицируется палочковидные бактерии?

11. Что такое бациллы? Привести примеры

12. По какому признаку классифицируется извитые?

13. Назовите шаровидные бактерии

14. Перечислите извитые бактерии?

Домашнее задание:

1. Оформление отчета по лабораторному занятию.

2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.