Определение титра двухэтапным бродильным методом

1 Этап:

Накопление бактерий кишечной группы на глюкозо-пептонной среде.

Различные объемы исследуемой воды (100, 10, 1, 0,1 мл...) в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения засевают в серию бродильных сосудов (колб, бутылок или пробирок с поплавками) с глюкозо-пептонной средой. Посевы воды в количестве 10 и 100 мл. производят соответственно в 1 и 10 мл. конц. среды. Воду в кол-ве 1 мл. и меньше засевают в пробирки со средой нормального состава. Сосуды осторожно встряхивают, перенося в термостат и выращивают 24 часа при температуре 42-45⁰ С. Посев объемов менее 1 мл. не допускается, используют разведение в стерильной воде.

2 Этап:

Через 7-12 часов инкубации посевы глюкозо-пептонной среде просматривают, отмечают признаки роста (муть и газообразование), и, независимо от признаков роста, из всех сосудов петлей с крупным ушком производят посев на розолово-днфференциальный агар. Сначала взятый материал слегка растирают в конденсированной жидкости, а затем делают укол в столбик, не доводя петлю до конца пробирки, при вытаскивании петли проводят ею штрих по скошенной поверхности агара. Пробирки с РДА с посевами выращивают при температуре 37⁰ С в течение 12-17 часов от момента посева воды в глюкозо-пептонную среду (посевы в бродильных сосудах с глюкозо-пептонной средой продолжают выращивать до 24 часов с момента заражения при 42-41° С).

Если через 7- 12 часов в высевах из этих сосудов на РДА роста нет, то делают повторный высев на РДА из всех бродильных сосудов и выращивают 10-12 часов при 37°С. Спустя 24 часа с момента высева воды и 12 часов после пересева просматривают РДА и отмечают результаты роста: изменение цвета среды, газообразование, характер роста на скошенной поверхности .

Признаки роста кишечной папочки на глюкозо-пептонной среде -газообразование и помутнение или только помутнение. На скошенной поверхности РДА изолированные желтые колонии или рост в виде желтого штриха на пожелтевшем столбике (столбик РДА окрашивается в желтый цвет с разрывами, конденсационная жидкость вспенивается). Для подтверждения наличия кишечной папочки готовят мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют.

При исследовании природных вод и вод в процессе очистки результаты считают отрицательными, если в глюкозо-пептонной среде наблюдается помутнение и газ или только помутнение, но РДА не изменяется. Значение коли-титра и коли-индекса находится по таблицам, приложенным к ГОСТу, составленным на основании статистических расчетов, определяющих вероятное распределение кишечных папочек в исследуемых объемах воды.

Организация и методика выполнения работы

1. Определение микробного числа воды.

Протереть руки тампоном смоченном в спирте. Обжечь кран горящим ватным тампоном, смоченном в спирте. Спустить воду 15 мин. Набрать пробу воды 500 мл. в стерильный цилиндр. Стерильной пипеткой взять пробу воды 1 мл., и вылить в стерильную чашку Петри. Выливая воду крышку чашки Петри поднимать ровно на столько чтобы вошла пипетка, и не более. Остудить МПА в пробирке до 37⁰С и вылить в чашку с водой. Перед тем как вылить агар из пробирки, края открытой пробирки следует обжечь на горелки. Агар, вылитый в чашку, осторожным движением смешивают с водой и круговым движением аккуратно распределяют по всей поверхности. При выливании агара крышку чашки приоткрывают ровно на столько, чтобы вошло горлышко пробирки, но не больше. На крышки чашки записывают все данные анализа, фамилию студента. Когда агар застынет чашку поворачивают донышком вверх и помещают в термостат при 37⁰ С на 24 часа.