Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі:

1. Антиген еңгізу.

2. Көк бауырдың жасұшаларын алу (10⁸).

3. Миеломды жасұшаларды алу (10⁷).

4. ПЭГ 4000 ортасында жасұшаларды қосу.

5. ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу.

6. Клондарды бөліп алу.

7. Дақылды суйықтықты антиденелер болуына тексеру.

8. Пассаждарда реклондау.

9. Дақылды суйықтықтан моноклоналды антиденелерді бөліп алу.

10. Клонды -70 градуста сақтау.

11. Асциттік ісік алу.

№ 1 сүрет. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі

Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.

Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 10⁸ көкбауыр жасұшаларын және 10⁶ перитонеалды жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.

Жұмыстарды ұйымдастыру және қолданылатын құрал-жабдықтар.

Гибридомаларды алу жұмыстарын бөлек бөлмеде өткізеді. Келесі құрал-жабдықтар болу керек:

1. Ламинарлы бокс.

2. Бір белгілі мөлшерде ылғалды, температураны, көмірқышқыл газды ұстап тұратын инкубатор.

3. Центрифуга.

4. Микроскоптар.

5. +4 және -200 градус ұстайтын холодильник.

6. +37 және +560 градуста жұмыс істейтін су моншасы.

Осыдан басқа бөлек бөлмеде жасұшалар сақтау үшін -700 градусты тоңазытқыш және суйық азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу үшін жасұшалардың дақылдарына арналған әдейленген пластикалы ыдыстарды дайындап қою керек. Олар: түбі тегіз 96-ұялы планшеталар, 24-ұялы планшеталар, көлемі 25, 75 см² пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арналған орталар, керекті реактивтер.

Экспериментке жануарды таңдау.

Иммунизацияға тышкандармен және егеу құйрықтылармен қолданады. Осы жануарлардың ағзаларында миеломды жасұшалар жақсы өседі. Басқа жануарлармен қолданбайды.

Бақылау сұрақтары:

1. Моноклоналды антиденелерді алу тарихы және ұстанымы.

2. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі.

3. Жұмыстарды өткізгенде қандай құрал-жабдықтармен қолданады?

ТАҚЫРЫП 9. Моноклоналды антиденелер (2 бөлім)

Сабақ мақсаты. Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу:

2. ГАТ ортасымен қолданып гибридтық жасұшалар алу, реклондау - клондарды дамыту, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттен өткізу және оларды тазалау.

Реклондау – клондарды дамыту.

Тірі қалған гибридомды жасұшаларды олар иммуноглобулиндер шығара бастағанша реклондайды. Іріктеп алған гибридтік жасұшаларды 1, 10, 100, 1000 жасұшалардан ұяларға салады. Моноклоналды антиденелер 12 күннен кейін жаратыла бастайды. Керекті клонды 20 мл ГАТ ортасына салады, сол пассажда сақтайды. 5 – 15 пассаж өткеннен кейін моноклоналды антиденелердің мөлшері ең көп болады. Клонның өмірге жарамдығы қоректік ортаның қоректік жасұшаларына байланысты.

Моноклоналды антиденелерді шығаратын клондарды 5 - 10, қай бір кезде 30 пассажға дейін апарып дамытуға болады. Кейіннен олар өмірге жарамды болады, бірақ ерекше иммуноглобулиндерді синтездемейді.

Антидене шығаратын клондардың көлемі антигендік препараттардың қасиетімен байланысты болып 2 - 20 пайыз құрайды. Клондар М- және G-класс иммуноглобулиндерді синтездейді.

Іріктеліп алған клонды сақтау керек. Іріктелген клондардың бір бөлегін -70 градус құрамында МДСИ, 20 пайыз қанның сары суы, 10 пайыз диметилсульфоксид бар ортада қатырады. Екінші бөлегін осы ортада суйық азотта сақтайды, клондың тағы бір бөлегін тышқандарда асцидтік ісік тұдыруға жібереді.

Іріктелген клонды асықпай, абайлап, кезеңмен қатырады. Жасұшаларды еріткенде жылдам 40 градуста су моншасында ерітеді.

Асцидтік ісікті алу.

Жануарлардан гибридомалар алу үшін, олардың қарындарының ішіне гибридтік жасұшалар жаратылу мақсатымен 0,5 мл тристан (тетраметилпептадекан) немесе Фрейнд адьювантын және тұзды буфердегі керекті клонның жуылған 1 – 2 мл (1 мл – 10 жасұша) жасұшаларын еңгізеді. Тышқанның ішінде ісік белгіленеді. Асцидтік суйықтықта моноклоналды антиденелерді анықтайды. Тышқанның қанының сары суында және асцидтік суйықтықта иммуноглобулиндердің көлемі 3 15 г/л, ал моноклоналды антиденелер – 50 мг/л. Бір тышқаннан 10 мл асцидтік суйықтықты алады. Асцидтік суйықтықты кейіннен тағын ісік алуға жіберуге болады (айына 1 рет) және серологиялық реакцияларда антигенді анықтағанда қолданады.

Моноклоналды антиденелерді тесттілеу.

Моноклоналды антиденелерді анықтау үшін сезімталды тест-жүйелермен қолданады: радиоиммунологиялық, иммунофлуоресценттік, иммуноферменттік.

Моноклоналды антиденелерді тесттілеуге арналған тест-жүйелердің компоненттері – тышқанның антисары суы және антигенді препараттар. Олар көп болу керек, неге десек, әр бір 3 күнде әр бір ұяның құрамын моноклоналды антиденелерін барына зерттейді. Осындай тесттілеуді сканирование деп атайды.

Бірінші сканирование қосылу өткеннен кейін он екінші күнде өткізіледі. Он реакция беретін гибридті жасұшаларды пассажға ауыстырып, бір ұяда бір клон болғанша көлемін арттырады.

Антиденлерді тазалау. Алынған дақылдың және асцидтік суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелерден басқа компоненттер болады. Оларды жою керек.

Иммуноглобулин М бөліп алғанда дақылды суйықтықтың 100 мл 28 гр аммоний сульфатын салады (45 пайыздық ерітінді). Қоспаны 12 сағат 4 градуста сақтайды, 20 минут 10000 об/мин центрифугаттайды. Тұнбаны 45 пайызды аммоний сульфатымен жуады, 10 мл 0,05М тристан буферінде орнына келтіреді, сефароза бар хроматографиялық колонкасынан өткізеді, 0,1М альфаметилгликозиді бар 0,05М трисбуфермен жуады.

Моноклоналды антиденелердің кейінгі қолдануы олардың титрімен, аффиндігімен, ерекшелігімен байланысты.

Афиндік – антидененің және антигенді детерминантаның қатнасу деңгейі. Моноклоналды антидененің титрі төмен, афиндігі әр түрлі болады.

Иммунохимияда және аффинді хроматографияда төменаффинді моноклоналды антиденелермен қолдануға болады, бірақ ИФА сараптауға моноклоналды антидене жоғары аффинді болу керек. Диагностикалық мақсатымен моноклоналды антидененің бір неше клондарының кешендерін қолданады.

Моноклоналды антиденелермен таза түрінде қолданбайды. Оларды ферменттермен және радиоизотоптармен таңбалап ИФА және РИА сараптауда қолданады.

Бақылау сұрақтары:

1. Клондарды дамыту тәртібі.

2. Асцидтік ісікті қалай алады?

3. Моноклоналды антиденелерді қандай мақсатпен тесттілейді?

4. Антиденелерді тазалау тәртібі.

ТАҚЫРЫП 10. Зерттеу жұмыстарында қаттыфазалық иммуноферменттік талдаумен қолдану

Сабақ мақсаты. Иммуноферменттік талдаумен және осы әдістің алдына қойылған мақсатпен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар. Реакцияға қатысты құрал-жабдықтар: Фюллеборн сынауықтары, микропипеткалар, 96 ұялы платалар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Иммуноферменттік талдаудын (ИФА) түрлері: «гомогендік» және «гетерогендік». Осы әдістердің бір бірінен айырмашылығы және өткізу ұстанымдары.

2. ИФАда қолданылатын ферменттер.

Ақырғы жылдарда иммунохимиялық сараптау әдістері белсенді даму жолына тұрып, биологияда маңызды проблемаларды шешуге көмектесіп, медицинада, ветеринарияда тәжірибе қолдану тауып отыр. Осы сараптау әдістерінің жоғары сезімталдығы және ерекшелігі (10^-9 – 10^-3 мг/мл) әдейленген маркер-изотоптар, флуоресцентті бояулар, ферменттер қолданумен жетіліп отыр.

Иммуноферментті сараптау (ИФА) – ферменттермен антигенді және антиденені таңбалау көмегімен әр түрлі физиологиялы белсенді заттарды анықтау әдістері. Өзінің сезімталдығына сәйкес ИФА радиоиммундық сараптауға тең болып бір қатар қасиеттеріне ие болды: ферменттермен таңбаланған реагенттердің тұрақтылығы, радиоактивтік заттармен қарым-қатынасқа кірмеу; реакцияны бақылау жеңіл болу (ферменттің әсерімен субстраттың түсі өзгеруі көзге байқалады).

ИФА әдістерін екі топқа бөлуге болады: «гетерогенді» (қаттыфазалы) және «гомогенді». Осы әдістердің айырмашылығы – сараптауды өткізу ұстанымдары.

ИФА «гетерогенді» әдістердің негізінде (ELISA – enzyme linked immosorbenti assay) ковалентті иммобилденген немесе ерімейтін негізде (целлюлоза, сефароза, 4В, сефадекс, биогель,ұсақ тесіктері бар шыны, ацетаттық және нитроцеллюлозалық мембранды сүзгіштер және т.б.) адсорбталған антигендермен және антиденелермен қолдану жатыр.

Ең көп таралған әдіс – антигенді және антиденені полистиролды ұялардың үстіне немесе сынауықтарға физикалық адсорбтау әдісі. Сараптау екі нұсқада өтеді: сәйкес келетін антигенге қарсы таңбаланған иммунды сары суды қолданатын тұра әдіс және зерттелетін ағзаның иммуноглобулиндеріне қарсы таңбаланған сары судың көмегімен – тұра емес әдіс. «Гомогенді» ИФА әдістерде (EMIT – enzyme multozid immunotest) фермент антигенмен коньюгатталады. Сол антиген байлану үдірісте қасиетін жоғалтпайды. Осы әдістердің негіздерінде антиденелермен таңбаланған антиген қарым қатынасқа кіргенде ферменттік белсенділік төмендейді. Ден саулық сақтау бағытында және ауыл шаруашылықта гомогендік әдістерге қарағанда реакция аяқталғанда екі фазасы жеңіл бөлінетін ELISA нұсқасы кең таралған.

ИФА әдісімен адамдардың, жануарлардың, өсімдіктердің бактериалдық және вирустік ауруларды зерттегенде, гормондарды анықтағанда, ісік антигендерін, наркотиктерді, антибиотиктерді, иммундық жүйелерді анықтағанда қолданады. Қаттыфазалық ИФА-мен ұлпалық дақылдарда моноклоналды антиденелердің синтезін өткізгенде қолданады.

Ветеринариялық тәжірибеде ИФА-мен инфекциялық аурулардың басты кезеңдерін анықтағанда , жануарлардың өнімдерінің ветеринариялы-санитариялық сараптауын өткізгенде қолданады. Осыдан басқа, осы әдіс вакциналармен және сары сулармен қолданғанда жануарлардың иммунобиологиялық жағдайларын анықтағанда көмектеседі. Иммунохимиялық сараптаулардың жалпы көлемінде иммуноферменттік сараптаудың әдістері зертханалық және клиникалық зерттеулерде болашақта бірінші орын алу мүмкін.

1. ИФА-да қолданылатын ферменттер

Қолданылатын ферменттерге келесі талаптар қойылады:

• Антигендермен антиденлер қарым-қатынасқа кіргенде тұрақтылығы және белсенділігі жоғары болу керек;

• Ферменттік коньюгатты (антиген-фермент және антидене-фермент) алғаннан кейін сақтағанда тұрақты болу керек;

• Ферменттік реакцияның өнімдерін анықтағанда аса күрделі болмау керек және сезімталды болу керек.

№1 кесте. ИФА-да қолданылатын ферменттер және олардың субстраттары

№	Ферменттер	Мол. салмақ	Субстарттар
1	Пероксидаза	40 000	Н2О2 ортофенилендиамин
2	Сілтілі фосфатаза	100 000	Р-нитрофенилфосфат
3	В-галактозидаза	518 000	О-нитрофенил-В-Д-галактозид
4	Глюкозооксидаза	150 000	Глюкоза, О2
5	Глюкозамилаза	90 000	Декстран
6	Ацетилхолинэстераза	250 000	Ацетилхолин
7	Лизоцим	14 000	Жасұшалы қабыршықтар
8	Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа	120 000	Глюкоза-6-фосфат НАД
9	Малат-дегидрогеназа	70 000	Малат, НАД
10	Люцифераза	80 000	АТФ, люцифин

Ферменттік коньюгатты дайындау

Ферменттік тамғаны еңгізу екі тобы белгілі: ферментті антиденемен (антигенмен) ковалентті байланыстыру және ковалентті емес әдіс. Ковалентті емес әдісте ферментпен антидененің (антигеннің) қарым қатынасы иммунологиялық болады (антиген-антидене арқылы). Ең көп қолданатын – иммуноферменттік кешеңдерді алу коваленттік әдістер. Фермент-иммуноглобулиннің (антииммуноглобулиндер) коньюгатын дайындағанда пероксидаза молекуласының көмірсулы белсенді бөлегін натрий периодатымен қышқылдатады. Кейіннен осы молекулалар NH₂-иммуноглобулиндер топтарымен қарым қатынасқа кіреді.

Құрал жабдықтар және материалдар

1. G-200 сефадексі бар хроматографтар.

2. Диализдік түтікшелер.

3. Ақжелкек пероксидазасы.

4. Ерекше иммуноглобулиндер немесе түрге қарсы антиденелер.

5. 0,1М натрий периодаты.

6. 0,001М ацетатты буфер, рН 4,4.

7. 0,2М бикарбонатты буфер, рН 9,5.

8. Дистилденген суда натрий боргидраты (4 мг/мл).

9. 0,1 бораттық буфер, рН 7,4.

10. Глицерин.

Әдіс

1. 4 мг ақжелкек пероксидазасын 1 мл дистилденген суда ерітеді.

2. 200 мкл жаңадан дайындаған натрий периодатын қосып бөлме температурасында 20 минут абайлап араластырады.

3. Ацетаттық буферге қарсы 4⁰С температурада 16-18 сағат диализдейді.

4. 20 мкл бикарбонатты буферді кіргізіп ортаның рН9,0-9,5 жеткізіп иммуноглобулиндердің (антиимууноглобулиндердің) фракциясының 1 мл қосады.

5. Жаңадан дайындалған натрий боргидраттың 100 мкл қосып 4⁰С 2 сағатқа қалдырады.

6. Бораттық буферге қарсы (4⁰С, 16-18 сағат) диализдейді.

7. Бораттық буфердегі 60 пайызды глицеринді қосып, 4⁰С сақтайды.

Байланысқа кірмеген иммуноглобулиндерді және ферментті босату мақсатамен G-200 сефадексте гель-сүзуді өткізеді. Коньюгат ферменттік және иммунохимиялық қасиеттерді бір жыл сақтайды.

Қаттыфазалық иммуноферментті сараптаудың ұстанымдары және қою техникасы

Таңбаланған түрге қарсы иммуноглобулиндермен қолданып антиденелерді анықтау

Осы жағдайда ИФА ұстанымы келесі: ферменттермен таңбаланған түрге қарсы антиденелер зерттеудегі антигенге сәйкес келетін антиденелермен ерекше қарым қатынасқа кіргенде жаратылған антиген-антидене кешенінің индикациясына жетуге болады.

Ферментпен коньюгатталған түрге қарсы иммуноглобулиндер - антисарысудан шығарылып алынған глобулиндік фракция. Антисарысуды алғанда жануарлар-продуценттерді энзимдермен таңбаланған бұқалардың, үй қояндардың, тышқандардың иммуноглобулиндерімен иммундеп алады.

Қатты фаза ретінде полистиролдық плашкалармен, ацетаттық мембранды сүзгіштермен, нитроцеллюлозалық сүзгіштермен қолданады.

Иммуноферменттік сараптау қою тәртібі:

1. Антигенмен тасымалдаушыны сенсибилиздеу.

2. Зерттелуге жататын құрамында антиденелер бар суйықтықты кіргізу.

3. Тасымалдаушыны жуу.

4. Пероксидазамен таңбалаған түрге қарсы иммуноглобулиндерді кіргізу.

5. Тасымалдаушыны жуу.

6. Субстратты қосу.

7. Реакцияны тоқтату.

Бақылау сұрақтары

1. Иммуноферменттік сараптау тұралы түсініктеме.

2. Иммуноферменттік сараптаудың негізінде қандай үдірістер жатыр?

3. Иммуноферменттік сараптауда қолданылатын ферменттер және құрал-жабдықтар.

4. Иммуноферменттік сараптауды қою тәртібі.

ТАҚЫРЫП 11. Тышқандардың және үй қояндардың иммундық жүйелерінің мүшелерін және жасұшаларын бөліп алу

Сабақ мақсаты. Жұқтыру жұмыстарының мағнасымен, тәртіптерімен және әдістерімен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Патогендік бактерияларды алу үшін қолданылатын жануарлар.

2. Вирустерді бөліп алу әдістер.

Жұқтырылған жануарлардан патогенді бактерияларды бөліп алу диагностика жұмыстарына өте маңызды, әсіресе иммунды сары суларды бақылау бағытта қолданғанда. Осындай жұмыстардың мақсаты – бактериялық зерттеулердің өткізу уақытын қысқарту.

Токсиннің әсерімен қоздырылып отырған инекцияны зерттегенде (мысалы, ботулизм немесе сібір жарасы), токсин немесе қоздырғыш бар материалды физиологиялық ерітіндіге салады. Кейіннен осы материалды талькпен сүртілген (токсинді адсорбтау үшін) қағаз сүзгіштен сүзеді. Сүзгіштен шайып алып, сол материалды сезімталды жануарларға жұқтыру мақсатымен салады.

Қоздырғыштың өзінің патогендік қасиеттерімен белгіленген инфекцияларды зерттегенде зертханалық жануарларға микробтық суйықтықты жұқтырады.

Бактериалдық инфекцияларды зерттегенде әр түрлі жануарлармен қолданады, неге десек олар әр түрлі этиологиялық агенттерге әр түрлі сезімталды болады.

Тышқандар пневмококкаларға, нейссерияларға, пастереллаларға, клостридияларға, листерияларға, сібір жарасының қоздырғыштарына, туляремия, оба, ботулизм, сіреспе, коклюш және мелиоидоз қоздырғыштарына сезімтал болады.

Егеу құйрықтылар туберкулёз (бұқа түрі), мелиоидоз және т. б. қоздырғыштардың түрлеріне сезімталды.

Теңіз шошқалар туберкулёз (адам түрі), дифтерия, сап, оба, бруцеллёз, туляреми, холера, газ гангренасының, ботулизм, псевдотуберкулёз және т. б.қоздырғыштарғка сезімталды.

Үй қояндар стафилококкаларға, стрептококкаларға, нейссерияларға сезімталды, Mycobacterium bovis, газ гангренасының қоздырғыштарына, сібір жарасының, ботулизм, сіреспе және т. Б. қоздырғыштарға сезімталды.

Мысықтар. Жануарларға стафилококкаларды, сап қоздырғыштарын, коклюш және т. б. қоздырғыштарды жұқтырады.

Маймылдар. Оларға шигеллаларды, листерияларды, сальмонеллаларды, мелиоидоз қоздырғыштарын, коклюш және т. б. қоздырғыштарды жұқтырады.

Құстар. Құстармен және көгершіндермен туберкулёз диагностикасында (құс түрі), пастереллёз, риносклерома және т. б. ауруларды зерттегенде қолданады.