СЕМЕЙ МЕМЛЕКЕТТІК МЕДИЦИНА УНИВЕРСИТЕТІ

СТУДЕНТТЕРГЕ АРНАЛҒАН ӘДІСТЕМЕЛІК ОҚУ- ҚҰРАЛЫ

Спектрофотометрлердің құрылысы мен жұмыс жасау принципі. Биологиялық сұйықтардағы зат концентрациясын анықтау үшін спектрофотометрлік зерттеу әдістерін қолдану.

Семей 2012 ж

Спектрофотометрия

Фотометрлік талдау әдісі заттың электромагнитті сәулелерді таңдап жұтуына негізделген әдіс. Әрбір біртекті орта белгілі толқын ұзындықтағы сәулелерді таңдап жұтуға қабілетті. Фотометрлік талдау әдісі қолданылатын аппаратураларға байланысты фотоколориметрлік және спектрофотометрлік деп бөлінеді.

Фотоколориметрлік әдісте түсті ерітінділердің жарықты жұтуы анықталады, бұл әдіс көбінесе ерітінділер концентрациясын анықтауда қолданылады және жарық сүзгіштер қолданылады, аппаратураның (күрделі емес аппаратура) өлшеу дәлдігі ( %).

Спектрофотометрлік әдісте аса күрделі құралдар- спектрофотометрлер қолданылады. Осындай құралдар түсті де, түссіз де қосылыстарды талдауға мүмкіндік береді. Бұл әдіс тек қана Бугер- Ламберт- Бер заңы жұту коэффициентінің зерттелуші заттардың концентрациясына тәуелсіздігі заңдылығы толығымен орындалғанда қолданылады.

Кейбір заттардың атомдары мен молекулаларының белгілі бір толқын ұзындықтағы жарықты жұту қасиеті бар. Осы қасиеті медицина мен фармацияда сапалы және сандық зерттеулерде кең қолданылады. Жұту спектрлерін өлшеу заттың химиялық құрамын, заттың күйін, түрлі химиялық заттардың таралымын (концентрациясын) анықтауға мүмкіндік береді. Спектрофотометрия әдісі қан сарысуын, жұлын сұйығын, зәрді, дәрілерді, тағам өнімдерін сандық және сапалық зерттеуде кең қолданылады және ерітінділердің концентрациясы да анықталады.

Спектрофотометрия – обьектілердің спектрлік сипаттамасын анықтайтын құралдар мен тәсілдерді құрастырумен шұғылданатын өлшеуіш техниканың бір саласы. Спектрофотометрия спектрдің көрінетін (400-760 нм), ультракүлгін (200-400 нм) және инфрақызыл (> 760 нм) аймақтарында жұтылу спектрлерін анықтау арқылы заттарды зерттеп, талдау әдісі. Спектрофотометрия- толқын ұзындығына байланысты жарықты жұту интенсивтілігін анықтау арқылы заттарды оптикалық зерттеу әдісі.

Көрінетін аймақтарда жұмыс жасайтын құралдарға комбинациялық шашырау спектрофотометрлері жатады, олар молекулалардың тербелмелі энергетикалық деңгейлерін оқып-зерттейді. Осы құралдарды ақуыздардағы байланыстарды, нуклеин қышқылдарындағы жұпты және жұпсыз негіздерді анықтау үшін қолдануға болады.

Микрообъектілер спектрофотометриясы (микроспектрофотометрия) зерттеудің жекеленген саласы. Микроспектрофлуориметрлер сияқты микроспектрофотометрлер де әдетте спектрдің көрінетін аймағында жұмыс жасауға негізделген. Спектрофотометрия биологиялық зерттеулерде кең қолданылады. Ол әртүрлі биологиялық қосылыстарды: ферменттерді, дәрумендерді, гормондарды, ақуыздарды, нуклеин қышқылдарын, көмірсуларды, спирттерді, альдегидтерді, фенолдарды, кетондарды, органикалық қышқылдарды, липидтерді, пигменттерді, бірқатар органикалық емес заттарды (мысалы, натрийді, калийді, кальцийді, темірді, цинкті, хлорды, күкіртті) сандық анықтауда қолданылады.

Медика-биологиялық зерттеулерде молекулалар мен атомдардың жұту спектрлерін талдаудың өте маңызды мәні бар. Спектрофотометрдің көмегімен түрлі биологиялық заттардағы (проба) ферменттердің, гормондардың, ақуыздардың, дәрумендердің, көптеген органикалық емес заттардың мөлшерін анықтап, қан жұғындысының құрамына сандық және сапалық талдау жасайды. Спектрофотометрияның негізі- зат арқылы өткен кезде монохроматты (бір толқын ұзындықтағы) жарықтың әлсіреу дәрежесін тіркеу болып табылады (Бугер- Ламберт- Бер заңы). Бугер- Ламберт- Бер заңы монохроматты жарықтың тек жазық параллель шоғыры үшін және белгілі бір шарттар орныдалғанда ғана дұрыс. Практикада осы заңнан ауытқушылықтар жиі кездеседі. Ауытқу себептеріне талдау жасалатын заттың не ерітіндінің физика-химиялық қасиеттерін (диссоциация, флюоресценция т.б.), құралдық факторларды (мысалы, жарық шоғырының монохроматтылығының нақты болмауы), жарық шоғырында зерттелетін обьектінің біртекті болмауын (көбінесе обьектілердің микроспектрофотометриясы кезінде айқын көрінеді) жатқызуға болады.

Спектрофотометрияның маңызды принципі оптикалық тығыздықтар принципі болып табылады, осы принципке сәйкес Бугер- Ламберт- Бер заңына бағынатын, бір- бірімен өзара химиялық әсерлеспейтін қосылыстардан тұратын қоспаның оптикалық тығыздығы осы қосылыстардың оптикалық тығыздықтарының қосындысына тең.

Бір заттан тұратын ерітіндіні сандық сипаттау мынадай операциялардан тұрады:

1) заттың толық жұту спектрін тіркеу (оптикалық тығыздықты толқын ұзындығының функциясы ретінде өлшейді);

2) талдау (анализ) үшін белгілі бір толқын ұзындықты таңдау ( );

3) 6-7 эталондық (стандартты) ерітінділерді дайындау;

4) осы ерітінділердің белгілі бір толқын ұзындықтағы ( ) оптикалық тығыздықтарын анықтау.

5) Одан кейін оптикалық тығыздық шамасының концентрацияға тәуелділік графигі салынады: D = f (С). Оптикалық тығыздық 0,05-1,50 аралығында нақты нәтижелерге ие болады.

Зерттелуге тиісті ерітіндінің оптикалық тығыздығы барлық жағдайда салыстырмалы ерітіндіге қатысты өлшенеді (тура спектрофотометрлік әдіс). Салыстырмалы ерітінді ретінде таза еріткіш немесе құрамында талданатын ерітіндінің барлық құраушылары бар ерітінді алынады (анықталатын заттан басқа). Кейбір жағдайда салыстырмалы ерітінді ретінде

анықталатын заттың концентрациясы белгілі ерітіндісін қолданған дұрыс (зерттелетін ерітіндінің концентрациясынан төмен болатын концентрациясын). Осындай өлшеулер жүргізген кезде дифференциалды спектрофотометрия қолданылады.

Спектрлік талдауға арналған құралдар өңдеуші және басқарушы электрондық қондырғылармен, зерттелетін ерітіндіні автоматты түрде орнататын, өзі жазатын, цифрлық баспа түрінде шығаратын блоктармен т.т. жабдықталады.

Құралдары.

Спектрофотометрияның құралы спектрофотометрлер деп аталады, олар жұту спектрлерін тіркеу үшін қолданылады. Осындай құралдар түсті де, түссіз де ерітінділерді зерттеуге мүмкіндік береді. Олар жарық көзінің санына (бір не екі сәулелік) және монохроматордың типіне байланысты бөлінеді. Монохроматор- монохроматты жарықты алуға негізделген оптикалық- механикалық құрал.

Спектрофотометрлердің негізгі бөліктері:

1) жарық (сәуле) көзі;

2) монохроматор;

3) сәуле қабылдағыш;

4) тіркегіш (индикатор).

Спектрофотометрлер бір сәулелік және екі сәулелік, тіркемейтін және тіркейтін деп бөлінеді (Сурет 1,2 ). Медициналық зертханаларда кең түрде қолданылатын бір сәулелік тіркемейтін спектрофотометрлер қарапайым және арзан құралдар болып табылады. Кварцты оптиканы қолдану спектрдің ультракүлгін, көрінетін жақын инфрақызыл аймақтарын қамтитын 200-1100 нм аралығында өлшеулер жүргізуге мүмкіндік береді. Зерттелетін ерітінді мен эталон ерітіндіні кезекпен жарық шоғырының жолына қояды. Жарық шоғырларын салыстыру нәтижесі өткізгіштік коэффициенті ( %) және оптикалық тығыздық (D) шамалары бойынша цифрлы құралда не тілі бар құралда көрсетіледі.

Спектрофотометрлерде жарық көзі ретінде әдетте сутегі шамы (спектрдің 220-320 нм аймағында жұмыс жасау үшін) немесе қыздыру шамы (спектрдің 320-1100 нм аймағында жұмыс жасау үшін) қолданылады. Жарық сәулесі айналар жүйесі арқылы шашыратқыш призмаға түсіріледі, призма жарық сәулесін жіктеп, спектрді береді.

Екі сәулелік тіркеуші спектрофотометрлерде сәуле көзінен шыққан жарық ағыны екі шоғырға бөлінеді: негізгі және салыстыру шоғыры (эталонды). Негізгі шоғыр жолына зерттелетін ерітінді, ал салыстыру шоғыры жолына эталон (белгілі) ерітінді қойылады. Ерітіндідегі заттың өткізгіштік коэффициентін анықтау кезінде бірдей екі кюветаларды қолданады, оның біреуіне зерттелетін ерітінді, екіншісіне эталон ерітінді құйылады. Сәуле қабылдағыш зерттелетін ерітінді арқылы өткен жарық шоғырымен және салыстыру шоғырымен кезек-кезек жарықтатылады. Яғни екі сәулелік спектрофотометрлерде екі өлшеу бір мезгілде жүргізіледі.

Жарық

Клиникадағы зертханалық диагностикада жүргізілетін көптеген зерттеулер түскен, шағылған, шашыраған жарықтың энергиясын өлшеуге негізделген. Жарық дегеніміз қызған дене шығаратын немесе зат қозған кезде шығаратын электромагниттік сәулеленудің бір бөлігі болып табылады. Жарық дегеніміз басқаша айтсақ, электромагниттік сәулеленудің адам көзімен көрінетін аймағы. Ол түрлі- түсті болып қабылданатын, ұзындығы әртүрлі толқындардан тұрады. Өте ұзын толқындар қызыл болып, ал өте қысқалары- күлгін болып қабылданады. Олардың аралығында қызғылт сары, сары, жасыл, көк, индиго (қара көк түс пен күлгіннің аралығындағы түс) орналасқан. Көрінетін жарықтың толқын ұзындығы 380-780 нм аралығында жатыр.

Жарықтың негізгі сипаттамаларының бірі- түсі болып табылады, жарықтың түсі монохроматты жарық үшін толқын ұзындығымен анықталады, ал күрделі сәуле үшін спектрлік құрамымен анықталады. Сонымен қатар жарық жиілікпен, толқын ұзындығымен, белгілі бір энергиямен, вакуумде таралу жылдамдығының тұрақты болуымен сипатталады. Жарықтың жиілігі мен толқын ұзындығы мынадай қатынаспен байланысқан:

Жарықтың физикалық қасиеттері күрделі. Жарық бір шарттарда өзін вакуумдегі таралу жылдамдығы тұрақты болатын электромагниттік толқын ретінде білдірсе, екінші бір шарттарда фотондар ағыны ретінде білдіреді. Фотондар- белгілі бір энергиясы, импульсі, импульстің меншікті моменті, нөлдік массасы бар бөлшектер болып табылады. Жарық ағынының (фотонның) энергиясы жарықтың жиілігіне тура пропорционал, ал толқын ұзындығына кері пропорционал:

Бірлік аудан арқылы өткен жарық энергиясының ағыны жарық энергиясының ағынының интенсивтілігі деп аталады.