Первичная обработка результатов измерений.

Итогом работы фотометра являются две численные матрицы значений оптических плотностей лунок планшета. Однако в конечном итоге пользователя интересует не оптическая плотность лунки в целом, а только ее содержимого и, как правило, только разница между «до и после» какой-либо реакции. То есть «перепад» оптических плотностей. Для получения значений перепада необходимо из второй матрицы вычесть первую -- разумеется, пользуясь режимом «автозаполнения», хотя желающие могут вычитать и по одной лунке (всего их 96!). Результирующую разностную матрицу следует начинать строить где-нибудь в клетке В22, чтобы обязательно сохранить первичные (исходные) данные.

Дальнейшую обработку (содержимое численной матрицы 3 -- разностной матрицы) – построение графиков, какие либо специаольные вычисления следует производить исходя из конкретных задач исследования.

3.3. построение концентрационной зависимости.

Зачем это нужно? – это калибровка прибора для конкретного объекта. Если эритроциты от друго вида животного, зависимость будет иная.

В общем случае концентрационная зависимость имеет вид примерно как на рис.3:

Рис.3. примерный вид зависимости фотоэлектрического сигнала от концентрации эритроцитов.

Для построения зависимости величины турбидиметрического ослабления (кажущейся оптической плотности) от концентрации клеток следует налить в каждую (не следует понимать буквально – всего лунок 94 , это - надолго!) лунку иммунологического планшета по 200 мкл изотонического раствора хлорида натрия (0,15М), а затем в каждую лунку добавить строго определенное количество суспензии эритроцитов или крови. Причем суспензию или кровь должно вносить в небольших объемах: 10 – 20 мкл. Причем в разные лунки вносится суспензия или кровь в разной степени разбавления. Пример: в лунку А1 вносим 10мкл неразбавленной крови, в А2 – 10мкл разбавленной в 2 раза. и т.д. Наиболее оптимальный вариант – 2 серии разбавлений и, соответственно измерений. Первая -- с десятикратными «шагами» разбавлений, чтобы грубо найти область «насыщения». Вторая – внутри линейной области с двухкратными шагами для уточнения границ линейной области и подтверждения линейности (или нелинейности – вдруг она вовсе нелинейна?).

После внесения крови или суспензии в каждую лунку плашку «шейкируют» на специальном шейкере для перемешивания содержимого лунок. Примерные условия шейкирования для эритроцитов: время – 3 минуты; число оборотов – 1100; температура – 25⁰С. После шейкирования проводят измерения значений величины турбидиметрического ослабления в каждой лунке по описанной выше методике.

Итогом этого этапа должно быть:

1. Кривая аналогичная рис.3 – для отчета;

2. Значение концентрации клеток соответствующее верхней границе линейности, методика разливания.

Пример: установлено, что верхняя граница соответствует концентрации 5^.10⁵ кл/мл. определенная прямым методом концентрация эритроцитов в исходной крови 5^.10⁵ кл/мкл. Следовательно, если в лунку вносить по 2 мкл крови – будет достигнута концентрация клеток 5^.10⁵ кл/мл. Однако, 2 мкл крови набрать технически сложно, проще разбавить кровь в 5 раз (к 100 мкл крови добавить 400 мкл физ. р-ра) и вносить в лунку по 10 мкл разбавленной крови, что технически проще.

Примечания.

1. Результаты на рис.3. по оси абсцисс могут быть представлены как в абсолютных значениях [клеточных тел/мл], так и в «относительных единицах разбавления». 100% соответствует исходная кровь или клеточная суспензия, а меньшие концентрации соответственно 10%, 1%, 0,1% и т.п. можно с процентами и не связываться, а принять исходное значение концентрации за 1. Тогда значения разбавленных концентраций можно представлять как 0,5, 0,1, 0,01 и т.п. Сам график рис.3 следует строить в полулогарифмическом масштабе (по оси Х – масштаб логарифмический, по У- обычный линейный).

Вопрос какой способ выбрать следует решать исходя из конкретного задания (или спросить у преподавателя). Если предложено выполнять полное исследование осморезистетности, то можно ограничиться относительными единицами, так как определение концентрации с помощью камеры Горяева займет много времени. Если предложен облегченный вариант – только калибровочная кривая, то следует обязательно результаты представлять в абсолютных единицах, времени хватит.

2. разумеется при построении калибровочной кривой необходимо для каждого значения концентрации клеточных тел сделать некоторое число повторов – минимум 3. использование планшетного фотометра да еще сопряженного с компьютером с прямой передачей данных в EXEL в отношении нахождения ошибки воспроизводимости и ее характеристик дает неограниченные возможности!

3.4. исследование осморезистентности.

Исследование распределения эритроцитов по осморезистетности

Для исследования распределения эритроцитов по осморезистетности необходимо в различные лунки плашки поместить по 200 мкл раствора NaCl, но в разных концентрациях. Напрмер, по убывающей, начиная с изотонического раствора – 0,155 М (0,9%) до 0,03 М (см. табл.1)

Таблица 1. Значения концентраций растворов хлорида натрия .

Конц.NaCl,M	0,155	0,150	0,145	.……	…	0,03
Р осм, Па

Примечание. Пустую строкн таблицы - осмотическое давление раствора следует заполнить самостоятельно.

Как приготовить растворы заданных концентраций. К сожалению, с 1992 года эта задача вызывает у студентов ВБ/ф затруднения. В общем случае если взять А мл раствора с концентрацией С₁ и добавить В мл растворителя (воды), то получим (А+В)мл раствора с концентрацией (1)

Обратная задача: надо получить раствор с концентрацией С₂, то сколько надо взять мл этого раствора (А=?) и сколько к нему добавить растворителя (В=?).

Решение. А – величина произвольная, выбирают¹ исходя из соображений сколько всего надо раствора, сколько есть исходного, сколько удобно набирать, какая нужна точность и т.п. проще всего взять А равным 10 мл.Тогда задача сводится к вопросу сколько взять В, чтобы С₁ превратить в С₂ :

(2)

пример: надо приготовить 0.6% раствор хлорида натрия. Берем 10 мл 0.9% раствора NaCl и добавлем:

Н₂О. Получаем 15 мл 0,6% раствора хлорида натрия.

Возможно и и другим способом приготовить нужные растворы. Допустим в качестве произвольно задаваемой величины мы выбираем не объем А, а конечный (суммарный А+В) объем раствора нужной концентрации. Обозначим его Д. Тогда:

(3) и (4)

пример: выбираем Д=10мл, то есть будем готовить растворы так, чтобы каждой концентрации вышло по 10 мл. Надо приготовить 0,4% раствор хлористого натрия. Берем 0,9% ( ) и добавляем воды

Чтобы не ошибиться при приготовлении растворов полезно заранее составить таблицу разбавлений (в лабораторном журнале должна быть). Ее очень удобно составлять пользуясь пакетом EXEL и режимом автозаполнения

Таблица 2. пример (только пример) Таблицы разбавлений для приготовления гипотонических растворов NaCl.

№	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Конц. У.е.	1	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1
А,мл(0,9% NaCl)	10						3		1
В,мл(Н2О)	0						7		10

Весьма полезно провести дублирующие заполнения. Например: дубль1 – лунки А1 – В12; дубль 2 – лунки С1 – D12 и т.д.

Важно при этом записать порядок заполнения лунок в журнал – в каких лунках, какой раствор. После заполнения лунок необходимо провести фотометрическое сканирование планшета на фотометре униплан по описанной выше методике. После измерений планшет следует вынуть из прибора для добавления в лунки крови.

В каждую лунку затем добавляем одинаковое количество концентрированной суспензии суспензии эритроцитов или крови. Добавлять следует в небольшом объеме – не больше 10мкл (в лункее есть 200 мкл среды, 10 мкл составят не более 5% объема; еще лучше добавлять не более 5 мкл). Добавляемое количество следует выбрать так, чтобы в кювете создалась концентрация эритроцитов вблизи верхней границы линейного участка (рис.3). Затем шейкируем планшет 5 минут  25⁰С  1100об/мин. В результате инкубации и шейкирования в лунках с гипотоническими растворами происходит гемолиз, но в разной степени. Затем проводим измерения по той же схеме, что и прежде. В результате получаем на листе EXEL две таблицы: первая соответствует фоновым значениям турбидиметрического ослабления для каждой лунки планшета, вторая - значениям т.ослабления суспензии эритроцитов + фон. Вычитая средствами EXEL первую таблицу из второй, получаем третью таблицу - значения т.ослабления для каждой лунки планшета, соответствуюющие содержащимся эритроцитам. Пользуясь значениями калибровочной кривой легко персчитать значения третьей таблица, полученные в единицах оптической плотности в концентрацию (%) негемолизированных клеток для каждой лунки.

При оформлении отчета следует построить интегральную и дифференциальную диаграммы распределения эритроцитов по осмотической устойчивости, пример построения диаграммы приведен на рисунке 4.

Рис.4 пример интегральной диаграммы распределения эритроцитов крысы по осмотической резистентности.

ПРИЛОЖЕНИя