НОВИКОВ В.Э.
Практикум
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ
ТУРБИДИМЕТРИЯ И НЕФЕЛОМЕТРИЯ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ
Задача № 7
ПЛАНШЕТНЫЙ ФОТОМЕТР УНИПЛАН
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДОМ ТУРБИДИМЕТРИИ.
методические указания
2005
Турбидиметрическим методом анализа (турбидиметрией) называют метод, основанный на измерении интенсивности света, прошедшего через светорассеивающую (мутную) среду, например, суспензию клеток. Интенсивность прошедшего через мутную среду света в общем случае зависит от светорассеяния и поглощения. При турбидиметрических измерениях поглощение стараются исключить соответствующим выбором длины волны падающего света. Например, при исследовании суспензии эритроцитов используют свет с длиной волны не менее 750 нм (красный и ближний инфракрасный).
Интенсивность прошедшего через мутный образец света -- НЕрассеяного (как и рассеяного) света зависит от концентации взвешенных частиц, их размеров, длины волны падающего света. Стандартизация условий измерения позволяет получать хорошо воспроизводимые концентрационные зависимости для различных клеточных взвесей. Для турбидиметрических измерений применяют фотометры построенные по принципу визуальных или фотоэлектрических колориметров.
1.Задача исследования.
Изучить распределение эритроцитов животного по осмотической устойчивости.
2.Порядок выполнения задания.
Исследовать и построить концентрационную зависимость светорассеивающих свойств суспензии эритроцитов для планшетного фотометра.
Определить концентрационные границы линейного участка построенной зависимости.
Исследовать распределение эритроцитов по осмотической резистентости.
Оформить отчет.
3. Пояснения к заданию.
3.1. какой в этой задаче смысл.
В традиционной клинической лабораторной диагностике применяется определение осмотической резистентности (по Лимбеку и Рибьеру или по Янковскому). Во всех случаях определяют лишь границы осмотической резистентности: минимальную и максимальную (минимальная – самая высокая концентрация хлорида натрия, где уже можно заметить гемолиз самых слабых эритроцитов; максимальная – самая низкая концентрация хлорида натрия где еще могут уцелеть сколько-нибудь самых стойких эритроцитов).
Клиническое значение – минимальная осмотическая резистентность становится заметно выше видовой нормы при гемолитической анемии и отравлениях свинцом (много клеток с понижением стойкости); слабо она повышается при токсикозах, бронхопневмониях, туберкулезе, малярии, лейкемии, миелосклерозе, лимфогрануломатозе, циррозе печени. – максимальная осмотическая резистетность понижается после больших кровопотерь (понижается стойкость клеткок и меньше доля стойких клеток), после спленэктомии, гемоглобинозе С, застойной желтухе, полицитемии.
Методически во всех случаях традиционных методик порцию крови разделяют на большое число пробирок с разной концентрацие хлористого натрия, затем инкубируют. Далее в одном из вариантов центрифугируют и находят две «крайние» пробирки, где прозрачный супернатант только порозовел и где окрашенный супернатант содержится вовсе без осадка (то есть где гемолиз прошел едва едва и где гемолиз прошел полностью). В другом варианте просто в каждой пробирке подстчитывают концентрацию негемолизированных клеточных тел с помощью счетной камеры.
принципиальное отличие предлагаемой в практикуме методики.
Весьма существенную информацию несет форма распределения клеток по осмотической резистетности, а не только положение границ устойчивости.
Для получения формы распределения требуется обработка большого числа образцов (много точек с различным осм. Давлением) за сравнительно короткое время, чтобы клетки последнего измеряемого образца не успели состариться пока до них дойдет очередь. Само измерение должно быть достаточно точным и технологичным. Эти требованиям идеально отвечает предлагаемый планшетный фотометр «УНИПЛАН» (иногда его именуют ИФА-фотометр для иммунологических исследований).
3.2. планшетный фотометр и работа с ним.
В данной задаче использован стандартный планшетный фотометр анализатор иммуноферментных реакций «УНИПЛАН» АИФР 01 (ТУ 9443-001-35924433-95), рекомендованный Минздравмедпромом к применению в медицинской практике. Государственная лицензия РФ. Сертификат Госстандарта № 9895. Патент № 2035716. Анализатор «УНИПЛАН» представляет собой настольный малогабаритный фотометр для измерения результатов иммуноферментного анализа и микробиологических исследований с использованием планшета, состоящего из 96 микрокювет (96 лунок). Принцип действия: вертикальный фотометр.
Фотометр может функционировать в двух конфигурациях: а) автономной – в этом случае он состоит из двух блоков – собственно фотометра и принтера; б)сопряженный с компьютером – в этом случае блока 3 – собственно фотометр, РС и принтер (не обязательно).
В случае автономной конфигурации, управление работой фотометра, измерения и математичская обработка результатов измерений (анализ), равно как и вывод результатов на печать осуществляются с помощью встроенного в фотометр микропроцессора. Последний снабжен большим пакетом «зашитых» в него программ, выбор, которых осуществляется пользователем с помощью клавиатуры расположенной на верхней лицевой панели фотометра (рис.2). Подробное описание пакета программ и набора методик стандартных исследований приведены в описании к фотометру (интересующиеся студенты могут получить заводское описание фотометра у преподавателя).
Однако при исследованиях выходящих за рамки жестко ограниченного набора стандартных методик приведенных в описании фотометра, более целесообразно использование конфигурации с РС. Последний вариант значительно упрощает работу с фотометром и практически неограниченно расширяет его возможности.
В этом случае работа все управление работой фотометра осуществляется компьютером с помощью специальной WINDOWS-совместимой программы, которая обеспечивает измерение значений оптической плотности содержимого лунок планшета и передачу полученных значений в буфер обмена для дальнейшей обработки любым подходящим пакетом программ (например EXEL).
Функциональная схема фотометра во второй конфигурации показана на рисунке 1.
Рис.1. функциональная схема измерительной установки. 1 – собственно фотометр; 2 – РС; 3 – принтер.
Подключение фотометра к компьютеру осуществляется стандартным образом через разъем RS-232 (COM-порт).
Конструктивно собственно фотометр состоит из оптического блока, блока движения планшета, блока управления и измерения ( блок микропроцессора с контроллерами), блока питания, объединенных в одном корпусе . Снаружи на корпусе находятся органы управления, цифровой дисплей и кюветное отделение (рис.2)
Рис.2. расположение органов управления планшетного фотометра. 1 – выключатель; 2 – планшетодержатель с планшетом; 3 – крышка под которой находятся измерительная головка и светофильтры; 4 – дисплей; 5 – клавиатура управления.
Внимание! При проведении измерения крышка прибора (3) должна быть обязательно закрыта.
Работа с планшетным фотометром.
1. Работу с фотометром начинают с включения фотометра переводом выключателя (1) в положение вкл. После этого должен загореться дисплей и начаться самотестирование фотометра. В случае нормального состояния всех систем прибора через 2 минуты на дисплее должно высветиться сообщение о готовности к работе.
2. включают компьютер и после загрузки WINDOWS загружают «EXEL» , затем заходят в опцию программы/uniplan. На экране монитора (на фоне интерфейса EXEL) должен установиться интерфейс программы «uniplan». Внутри окошка интерфейса должна гореть надпись «связь с прибором установлена», а по обрамлению надписи -- рисунок иммунологического плапланшета (цифры 1 –12 по горизонтали, буквы А – Н). В противном случае следует обратиться к преподавателю.
3. зайти в опцию «настройки» и установить /выбрать число стрипов (вертикальных рядов планшета), необходимое для работы (для задач практикума -- 12).
4. На рамку планшетодержателя (2) установить планшет со средой инкубации. Планшет установить в рамке с учетом люфта – прижав до упора вперед и вправо (на приборе в нужном углу нарисована стрелка). Щелкнуть опцию «измерение» левой кнопкой мыши. Прибор начнет измерение, которое будет происходить около 1 минуты (будут фотометрически сканированы поочередно все лунки планшета). После окончания измерения в течение одной минуты на экране будет высвечиваться надпись «идет анализ» или подобная, затем высветятся значения оптических плотностей всех сканированных лунок планшета.
5. зайти в опцию файл/копирование в буфер обмена – данные будут скопированы в буфер обмена.
6. свернуть (только свернуть!) окошко программы «uniplan» -- на экране вновь только интерфейс exel. Пиктограмма «вставить» на панели инструментов exel теперь активна – буфер обмена полон. Сделать активной клетку В2 и щелкнуть левой клавишей мыши по пиктограмме «вставить» -- 96 клеток окажутся заполнены значениями оптических плотностей соответствующих лунок планшета. Полезно в строке 1 сделать обозначения номеров стрипов, а в столбце А – позиций лунок (ряд 1,2,3…. И столбец А,В,С…).
7. сохранить результат в папке exel «студенты» под своей фамилией.
8. вынуть планшет и добавить в каждую лунку нужный реагент – кровь, или раствор какой-либо соли, кислоты и т.п., провести инкубацию и т.п. (все зависит от конкретной задачи исследования).
9. Вставить планшет в фотометр и развернуть окно «uniplan». Повторить пункты 4, 5, 6, но только теперь в exel данные из буфера обмена вставлять в клетку В12, а не в клетку В2.
10. сохранить данные.
11. закрыть программу «uniplan» и выключить фотометр.
12. обработать результаты измерений с помощью exel.
В отчете обязательно должно быть :
1)график зависимости турбидиметрического ослабления от концентрации клеточных тел и обоснованный вывод рабочего разбавления крови;
2)куммуллята распределения эритроцитов по осморезистетности;
3) гистограмма распределения эритроцитов по осморезистетности.
А также выводы и постановка задачи, описание методики, таблицы с результатами измерений.