Как придать координатам точек а, в, с физическую размерность?

1. координаты Хi. С ними все очень просто - это ось времени, начало отсчета координата Х1. Масштаб зависит от скорости лентопротяжки самописца V (в задаче практикума V=0.33 мм/секунду). Отсюда:

[Х1] секунд = Х1мм*V =0 = Х1с

[Х2] = Х2мм*V = Х2с

[Х3] = Х3мм*V = Х3с

2. координаты Уi. Размерность позволяет внести значение координаты У1. Названная величина соответствует перепаду парциального давления кислорода в ячейке от 159 мм.рт.ст. до 15 мм.рт.ст. (с чего взялось смотри в разделе "методика калибровки"). Согласно закону Генри концентрация газа в воде пропорциональна его парциальному давлению, следовательно концентрация кислорода упала в (159/15) 10.6 раза. Допустим, для примера, что температура среды была 25 градусов. Пользуясь таблицей растворимости (см. приложение) найдем, что концентрация кислорода изменилась от 0.025М до 0.0024М (напомню, что М означает МОЛЬ/литр). Отсюда У1 соответствует (0.025М - 0.0024М)=0.0226М. Разделив последнее значение на У1 в мм. найдем цену в молях кислорода 1 мм по оси У. Обозначим эту величину К1: К1= 0.0226/У1 [М/мм]. Теперь [ У2]М = К1*У2мм - обозначим как У2М [ У3]М = К1*У3мм - обозначим как У3М Для получения конечного результата необходимо также знать концентрацию клеточных тел. Удобнее всего ее выражать для объема 1 литр, тогда все будет приведено к 1 объему. Обозначим ее N [клеток/литр]. Например, N= 20000000 кл/л.

Наконец можно перейти к главному вычислению скорости процесса (она же активность ферментного ансамбля).Обозначим активность фермента как . Поскольку на кривой мы выделили три точки и соответствующие им два участка, можно вычислить два значения : 1 и 2, а потом взять среднее:

Здесь полезно отметить, что сравнение 1 и 2 дает простой критерий корректности линейной апроксимации участка АС кривой динамики кислорода. Хотя бы 10% различия, то уже неплохо. Если больше, то надо сужать участок АС или вообще считать, что кривая получена для слишком высокой концентрации клеток - им сразу стало " нехватать кислорода".

Чтобы иметь право считать данные определения активности фермента корректными следует убедиться, что изменение концентрации клеток в два-три раза (как в большую, так и в меньшую сторону) дает тот же результат.

8. Как определять константу проницаемости мембран по кислороду.

задание снято

9. Как правильно измерять энергию активации ферментативных реакций.

задание снято

10.Как оформлять отчет.

Отчет должен включать разделы:

1. Материалы и методы - описание методики измерения и приготовления объекта - кратко.

1. Первичные результаты - подклеить в тетрадь все диаграммные ленты, с нанесенной на них обработкой. Также следует указать температуру измерений и концентрацию клеток для каждой кривой.

Разумеется, кривых должно быть несколько: часть посвящена выбор удачной концентрации клеток и, минимум, три доказывающих корректность определения активности фермента.

1. Расчеты - все подробно, четко, чтобы преподаватель мог быстро понять - что именно и как сделано.

1. Выводы. - констатация результата (как ответ в задаче). Пример:

активность ферментного ансамбля при сбраживании сахарозы составляет .......... молей кислорода в секунду на 1 клетку. При сбраживании глюкозы ...... и т.п.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. что же все-таки надо делать?

чаще всего надо: нагреть термостат, камеру, приборы. Приготовить КОНЦЕНТРИРОВАННУЮ (1 ЧАЙНАЯ ЛОЖКА КЛЕТОК В 10-30 МЛ СРЕДЫ) суспензию клеток. Добиться записи 1 кривой с максимальной концентрацией клеток влить в нужный момент 3-5 мл исходной суспензии в камеру. Затем все несколько раз повторить уменьшая концентрацию клеток всякий раз (вдвое). Потом, при обработке, из полученного семейства кривых выбрать нужные.

Ушлый студент после первой кривой сообразит подойти к преподавателю и спросить: какое стоит взять следующее разбавление клеток исходя из уже полученной кривой?

Плохой студент (тот который не думает головой, а делает по-принципу делай раз, делай два etc) обычно допускает следующую главную ошибку: сразу в среду добавляет клетки, а потом начинает регистрацию кислорода.

При определении активности ферментов всегда вначале готовят среду инкубации, регистрируют начальный уровень субстрата-маркера, и лишь затем, вводят фермент в реакционную смесь.

Другая ошибка - не понимают, что для последующего измерения надо все в камере заменить на свежее.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2.

как готовить дрожжи?

-очень просто: взять 1-2 мл сухих дрожжей или 1 чайную (примерно)

ложку брикетированных дрожжей и развести в 5-20 мл 0.15М раствора КCl.

Не вредно будет использовать для разведения и среду инкубации 1% раствор глюкозы (или сахарозы, или что еще скажет преподаватель) в 0.15М КСl. Обязательно надо знать концентрацию клеточных тел в этой суспензии. Определять ее проще всего микроскопически с помощью счетной камеры.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3.

как пользоваться счетными камерами?

В условиях практикума "биофизика клетки" концентрацию клеток в приготовленных суспензиях проще всего определять путем подсчета в камерах типа камеры Горяева или камеры Фукса-Розенталя. Возможно еще определение с автоматических счетчиков форменных элементов типа" Целлоскоп" или "Пикаскель". Однако, для автоматических счетчиков необходима специальная насадка с микро-отверстием калиброванного диаметра. Счетчики работают по принципу продавливания суспензии клеток через калиброванное отверстие с заданной скоростью. Подсчет частиц (клеток и т.п.) происходит электрометрическим методом, с автоматической регистрацией. Насадка давно украдена студентами, а самостоятельное изготовление такой насадки весьма затруднительно.

При работе со счетными камерами также есть аналогичные трудности - требуются специальные шлифованные покровные стекла. Академия давно не снабжается такими стеклами, а имевшийся на кафедре значительный запас также украден студентами, небольшое количество лежавшее непосредственно на рабочих местах практикума - раздавлено студентами. Тем не менее, данную трудность можно обойти, если учитывать принцип устройства счетной камеры.

Счетные камеры состоят из толстого предметного стекла с нанесенными поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0.1мм (в камере Фукса-Розенталя на 0.2 мм) выше средней. Плоскости этих площадок служат для ПРИТИРАНИЯ ПОКРОВНОГО СТЕКЛА ДО ПОЯВЛЕНИЯ так называемых НЬЮТОНОВЫХ КОЛЕЦ. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (капиллярные пространства, через которые и заполняют камеру.

Следовательно, если обычное покровное стекло достаточно плотно прижать к поверхности боковых площадок, то, в принципе, получим такой же зазор (0.1 или 0.2 мм). Иногда удается и притереть обычное покровное стекло к поверхности площадок до появления Ньютоновых колец, но чаще оно при этом просто давится. Кстати, чтобы притирать шлифованные или любые другие поверхности до такой степени слипания, поверхности должны быть хорошо обезжирены. Плотно прижать покровное стекло можно, если использовать дополнительные пружины препаратоводителя столика микроскопа.

Принцип сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных.

Постоянной величиной во всех сетках является "малый квадрат", Сетка камеры Горяева (рис.1а) содержит 225 больших квадратов - 15 рядов по 15 больших квадратов в каждом - разграфленных вертикально, горизонтально, крест на крест и неразграфленных.

Большие квадраты сетки Фукса-Розенталя (рис.1a) не разграфлены, сгруппированы по 16 квадратов, каждая группа ограничена тройными линиями.

Подсчет форменных элементов в камерах производят по формуле:

(7)

где: Х - количество форменных элементов в 1 мкл ( 1 мм³)

А - сумма всех сосчитанных форменных элементов

В - количество сосчитанных малых квадратов

С - разведение исходной суспензии (во сколько раз развели).

V - объем одного малого квадрата.

L - длина стороны малого квадрата

D - глубина камеры

Зачем надо разводить? - Исходная суспензия настолько концентрирована, что если ее не развести раз в 200, то сосчитать клетки невозможно, слишком густо в поле зрения.

Для разведения используют или МЕЛАНЖЕР от ГЕМОМЕТРА САЛИ или микродозатор.

При работе с камерами их рабочие поверхности должны быть чистыми и сухими.

К сухой счетной камере притирают сухое покровное стекло, а потом заполняют капиллярное пространство.

Кровь (или суспензию клеток) из пробирки берут или пипеткой или концом стеклянной палочки,: осторожно вносят каплю суспензии в торцевую щель капиллярного пространства. Камеру следует заполнять так, чтобы вся поверхность, на которой нанесена сетка была заполнена жидкостью без затекания ее в бороздки и без пузырьков воздуха.

После заполнения оставляют камеру на 1 минуту в покое для оседания форменных элементов. Затем камеру следует положить на столик микроскопа, КОТОРЫЙ ДОЛЖЕН БЫТЬ СТРОГО ГОРИЗОНТАЛЬНЫМ и приступают к подсчету форменных элементов при малом увеличении микроскопа (объектив х8, окуляр х10 или х15). Для лучшей визуализации стоит затемнить поле зрения - закрыть диафрагму или опустить конденсор.

В практикуме используется камера, которая сразу вделана в столик микроскопа, а покровное стекло можно не притирать - оно прижимается специальными пружинами.

В случаях, когда требуется большая точность, клетки считают на 2 сетках и результат берут среднеарифметический. Клетки считают в 5 больших квадратах (80 малых), расположенных по диагонали. Подсчету подлежат все клетки , лежащие внутри маленького квадрата, и те, которые находятся на левой и верхней линиях его или касаются их с той или другой стороны. Клетки, расположенные на правой и нижней линиях или касающиеся их с обеих сторон не считают, так как они будут сосчитаны в следующем квадрате. Результаты подсчета в каждом большом квадрате откладывают на 11 клавишном счетчике или записывают в столбик и затем суммируют.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАМЕР

Сторона малого квадрата в камере Фукса-Розенталя - 0.25  0.001 мм

Сторона большого квадрата - 1.0  0.0015мм

Сторона сетки - 4  0.005мм

Глубина камеры 0.2  0.0005 мм

Сторона малого квадрата в камере Горяева - 0.05  0.001мм

Сторона большого квадрата - 0.2  0.0015мм

Сторона сетки - 3  0.005мм

Глубина камеры - 0.1  0.008мм

При соблюдении описанного режиме подсчета и соблюдении метрологических характеристик камеры ошибка достигает 2 - 3%

ПРИЛОЖЕНИЕ 4.

таблицы растворимости кислорода в воде, в зависимости от температуры раствора. Давление воздуха 760 мм.рт.ст., парциальное давление кислорода 159 мм.рт.ст. концентрация соли 0.15М (КСl или NaCl)

Температура	15	16	17		18	19	20	21	22
Кщэф.растворимости.	.034	.0333	.0327		.0321	.0315	.0310	.0304	.0300
Температура	23	24	25		26	27	28	29	30
Коэф.раств.	.0294	.0289	.0284		.0279	.0275	.0271	.0266	.0262
Температура	31	32	33		34	35	36	37	38
Коэф.раств.	.0275	.0254	.0251		.0248	.0245	.0242	.0239	.0237
температура	39	40
коэф.раств.	.0234	.0231

как пользоваться коэффициентом растворимости или какова его размерность?

размерность коэффициентов - относительные единицы, а чтобы найти сколько мг кислорода растворено в 1 литре воды при данной температуре необходимо взять коэффициент растворимости для данной температуры и умножить его на 303.

Пример: какова растворимость кислорода в воде при 33 градусах? ответ: в воде при данной температуре растворяется при парциальном давлении кислорода 159 мм.рт.ст. 0.0251*303 мг кислорода, или 7.6356 мг кислорода/литр. или 0.0002386 М.