Задание снято.
4. Методика калибровки.
Задание в классическом виде снято из-за отсутствия инертного газа.
Калибровку выполнять по дрожжевым клеткам.
Измерение проводить согласно методике регистрации динамики дыхания клеток (см.).
Исходный уровень парциального давления кислорода считать равным 159 мм.рт.ст. (сколько в Паскалях?). Уровень соответствующий концу дыхания клеток (рис.6) считать равным 15 мм.рт.ст. (Паскалей?).
Рис.6 примерный вид кривой динамики дыхания клеток, записанный на диаграммной ленте самописца.
Пользуясь полученной диаграммой легко найти СКОЛЬКО ММ ОТКЛОНЕНИЯ ПЕРА САМОПИСЦА СООТВЕТСТВУЮТ ИЗМЕНЕНИЮ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА НА 144 ММ.РТ.СТ.
Считая кислородную зависимость силы тока измерительного электрода от парциального давления кислорода линейной можно вычислить коэффициент пересчета мм. отклонения пера в парциальное давление кислорода в Паскалях. Если же воспользоваться таблицей растворимости кислорода (см. приложение) то можно сразу и к концентрации кислорода перейти.
5. Методика регистрации динамики дыхания клеток.
Логическая схема регистрации динамики дыхания: "прописывают" на диаграммной ленте самописца исходный уровень кислорода в среде инкубации без клеток, затем вводят в малом объеме концентрированную суспензию клеток и ждут пока уровень сигнала не упадет до постоянной величины.
Порядок действий.
Включить все приборы и дать им прогреться.
Выставить на контактном термометре ультратермостат необходимую температуру (спросить у преподавателя) и дождаться ее установления в термостате.
Залить в камеру ячейки 50 мл среды инкубации. Если преподаватель не сделает спец. указаний - то среда инкубации 1% раствор сахарозы или глюкозы приготовленный на 0.15М KCl.
Установить камеру на штатив так, чтобы захлопнулись защелки.
Дождаться установления температуры в камере и включить лентопротяжный механизм самописца (тумблер "диаграмма" на лицевой панели самописца).
Дождаться успокоения системы - этому соответствует запись ровной вертикальной шумовой дорожки на ленте.
Через воронку в крышке камеры ввести в камеру строго отмеренное количество суспензии дрожжей в объеме не более 5 мл (лучше 1 мл).
Дождаться снижения сигнала до постоянного уровня и выключить лентопротяжный механизм.
Осторожно, чтобы не сломать защелки, снять камеру и вылить содержимое в стакан с надписью "СЛИВ". Дважды промыть камеру водой и один раз средой инкубации. Стаканом на 100 мл с чистой средой инкубации промыть электродную систему.
Если окажется, что перепад сигнала занимает малую часть шкалы диаграммной ленты можно произвести "растяжку шкалы" для последующих измерений меняя усиление и "0".
6.Методика регистрации динамики выделения клетками кислорода.
Задача снята.
7. Как правильно измерять активность ферментов и в каких единицах.
А также как обрабатывать результаты.
Определяют активность какого либо фермента, обычно, по скорости изменения концентрации соответствующего субстрата. При этом важно чтобы фермент был НАСЫЩЕН по субстрату. В этом случае, скорость реакции будет зависеть только от активности фермента. Последняя, в свою очередь, конечно, зависит от концентрации фермента, температуры, РН среды и т.п. Физико-химически параметры среды обычно стабилизируют: раствор "забуферивают" по РН, термостатируют реактор (сосуд, где идет ферментативный процесс). Концентрацию фермента условно задают по какому-либо удобному параметру, например, по количеству белка клеточной фракции, или по концентрации клеточных тел и т.п.
Если в реакции участвует более одного субстрата, то активность фермента определяют по скорости утилизации одного из субстратов, в отношении остальных лишь следят, чтобы все время наблюдения они были в избытке.
В нашем, конкретном, случае дышат дрожжи: концентрацию фермента удобно считать по числу клеток, субстратов два - кислород и глюкоза (или сахароза). Кислород в маленьком объеме ячейки кончается гораздо раньше, чем сбраживается глюкоза. Кстати это легко рассчитать надо только знать исходное количество кислорода - объем раствора 50 мл, исходное парциальное давление кислорода 159 мм.рт.ст.,при 25 градусах по Цельсию в 1 литре физ. раствора растворяется около 0.25*10-3 Моля кислорода. В 50 мл в 20 раз меньше - 0.125*10-4 Моля кислорода. А дальше всякий студент хоть чуть-чуть знающий химию сообразит сколько глюкозы или сахарозы может окислить такое количество кислорода.
Таким образом у нас осталась только одна проблема насыщенность ферментов по кислороду . Если ферменты насыщены по кислороду - то снижение концентрации кислорода должно быть линейной во времени зависимостью, то есть процессом идущей с постоянной скоростью. Зарегистрированный же на ленте процесс (рис.5) линейным не назовешь даже глядя невооруженным взглядом. Кроме того, в случае насыщенности ферментов по кислороду изменение количества фермента, например, вдвое должно сопровождаться аналогичным изменением скорости процесса.
В таких случаях поступают следующим образом. Полагая, что в самом начале процесса все же существовал момент, когда скорость процесса была постоянна ищут участок на кривой, который удовлетворительно соответствует названному этапу. При "ручной" обработке - это начальный участок динамики кислорода сразу после добавления клеток, до момента "загиба" кривой. При машинной обработке пользуются специальной программой обработки подобных кривых с поиском участка, для которого допустима линейная апроксимация с наперед заданной точностью. Можно, конечно так проделать и "вручную" на калькуляторе. В любом случае потребуются координаты нескольких точек начального участка кривой.
В каких единицах выражать активность ферментов? Как любую скорость реакции количество вещества в единице объема в единицу времени, но в отличие от обычной химии еще не единицу фермента.
Для тех кому непонятно, пример для конкретного случая задачи практикума: "в результате измерений определена активность ферментного ансамбля дрожжевых клеток (F.sp) 0.0004M/c*кл" . [Моль/(секунда*клетка)] или [0.0004 моля в секунду кислорода на 1 клетку].
И вообще, господа студенты, (кто пойдет в науки) учтите, что всякие там "относительные единицы" - это не лучший тон. По возможности всегда старайтесь в своих результатах найти ответ с РЕАЛЬНОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ РАЗМЕРНОСТЬЮ.
Пример обработки отдельной кривой динамики кислорода.
В качестве примера разберем обработку кривой уже показанной на рис.6, необходимый фрагмент ее теперь показан увеличенным:
Рис.7. Обработка кривой динамики кислорода (дыхание клеток).
1. Участок кривой, для которого, как мы полагаем, допустима линейная апроксимация выделен квадратом. На нем выбраны три точки: А, В, С; координаты названных точек находим опуская соответствующие перпендикуляры. Координаты обозначены Уi и Хi. Размерность координат точек миллиметры. Кстати, сразу отметим, что координата Х1 точки А соответствует началу отсчета времени и ее значение равно 0 (момент внесения клеток).
При внесении клеток иногда бывает на кривой "всплеск" связанный с возмущением среды, при расчетах им пренебрегают экстраполируя данный участок к начальному уровню кислорода.
2. Целесообразно сразу координатам придать физическую размерность, чтобы потом ничего не путать. Если есть готовая программа обработки, она запросит лишь координаты точек (сама скажет каких и сколько надо), а все остальное сделает сама, но то же самое, что здесь описано, может только получше.