Новиков В.Э.
ПРАКТИКУМ
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ
Кислородометрия
Биоэнергетика клетки
Кинетика ферментативного катализа
Проницаемость мембран
ЗАДАЧА № 6
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ДЫХАНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ (АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ) МЕТОДОМ
методические указания
2001
Выпускникам ветеринарно-биологического факультета довольно часто приходится сталкиваться в своей работе (разумеется, тем которые остались верными своей специальности) с задачами регистрации кинетики дыхания, равно как и с задачами измерения активности ферментов. Где именно встают подобные задачи? Проблемы кислородометрии прежде всего возникают как задачи контроля параметров роста клеток в культурах при промышленном культивировании или при необходимости непрерывного контроля процессов вроде спиртового брожения. Возникают они и в чисто научных, а иногда и клинических исследованиях. Например, при измерениях дыхательной активности митохондрий (кстати сейчас в экологическом мониторинге довольно широко используют как тест-систему).
Практика показывает, что многие студенты академии сталкиваются уже при выполнении дипломных работ с названными задачами, причем кислородометрия вызывает порой методические затруднения, а о корректном определении активности фермента студенты просто не имеют понятия.
При выполнении настоящей задачи практикума студенты познакомятся с принципами измерения в кинетике ферментативного катализа, а также с техникой регистрации напряжения кислорода в растворах. В качестве конкретной задачи исследования предлагается выполнить за одно занятие одно или два из ЗАДАНИЙ по усмотрению преподавателя.
Каждое задание непременно включает одну и ту же задачу измерения - регистрировать динамику концентрации кислорода в водных средах, находящихся специальном сосуде - полярографической (электрохимической) ячейке, где могут находится дышащие или выделяющие кислород клетки. В ряде заданий (калибровки) вместо клеток используются другие агенты меняющие концентрацию кислорода в ячейке.
Варианты заданий.
провести калибровку измерительного электрода по кислороду и определить численное значение коэффициента крутизны электрода.
определить активность по кислороду дыхательного ферментного ансамбля дрожжевых клеток (или сперматозоидов с/х животных) при сбраживании глюкозы.
определить активность по кислороду дыхательного ферментного ансамбля дрожжевых клеток (или сперматозоидов с/х животных) при сбраживании сахарозы.
определить энергию активации для заданий (2) и (3).Интервал температур уточнить у преподавателя.
определить коэффициент проницаемости мембран эритроцитов по кислороду в изотонических условиях.
то же, что и (5), но в гипотонических и гипертонических условиях.
измерить полярограмму восстановления кислорода на платиновом электроде.
Пояснения к заданиям.
1. СТРУКТУРА ПОЯСНЕНИЙ .
Пояснения к заданиям состоят из разделов:
принцип метода (в предельно упрощенном виде).
конструкция установки.
методика регистрации полярограммы.
методика калибровки.
методика регистрации динамики дыхания клеток.
методика регистрации динамики выделения клетками кислорода.
как правильно измерять активность ферментов и в каких единицах.
как определять константу проницаемости мембран по кислороду.
как правильно измерять энергию активации ферментативных реакций.
как оформлять отчет.
Кроме того, в конце настоящего пособия имеются приложения, где может оказаться более подробная теория, а также всякие сведения по-поводу приготовления объектов и растворов, таблицы растворимости кислорода и т.п.
1.Принцип метода. ( в очень упрощенном виде!)
Если в сосуд с каким-либо изотоническим водным раствором (проще всего хлористого калия) опустить два стержня из проводников первого рода, причем чтобы площадь поверхности одного из них в десять (а лучше в десять тысяч) раз была больше площади поверхности другого, к маленькому электроду приложить -0.8 вольта относительно большого электрода, то сила тока при этом будет пропорциональна концентрации кислорода в ячейке. Материал электродов лучше всего взять химически инертный. Для большого электрода может подойти даже уголь, для маленького - платина или золото (вообще-то необязательно). Маленький электрод называется измерительным, большой - индифферентным или вспомогательным.
Рис.1. Схема простейшего устройства для измерения концентрации (парциального давления) кислорода в растворе.
Рис.2.Зависимость силы тока от парциального давления (концентрации) кислорода в растворе.
Часто вместо концентрации растворенного кислорода используют величину парциального давления кислорода - рО2. При одном и том же парциальном давлении кислорода над раствором - концентрация кислорода может оказаться действительно различной. Это зависит от растворимости кислорода, которая, в свою очередь, зависит от температуры, солености и т.п.
Однако, при постоянстве условий, согласно закону Генри (см. курс физ. химии) между парциальным давлением кислорода над раствором и концентрацией кислорода в растворе жесткая зависимость:
где К - коэффициент растворимости кислорода при данных условиях, размерность К - М/Па