1. Некоторые сведения из коллоидной химии.

Достаточно мелкие частицы диспергированные в жидкости (воде) называют ДИСПЕРСНОЙ ФАЗОЙ. Саму жидкость при этом, называют ДИСПЕРСИОННОЙ СРЕДОЙ. Если суспензия (или эмульсия) устойчива, то скорее всего оседанию дисперсной фазы (или слипанию) препятствует электростатический заряд частиц. Последний должен быть у всех взвешенных частиц одинаков по знаку, они "электрооталкиваются" - потому и не оседают (или не слипаются). Природа заряда может разная (см. любой хороший курс Коллоидной химии). Наличие заряда на частицах, а также границы раздела фаз обуславливает определенное электрохимическое взаимодействие дисперсионной среды и дисперсной фазы, вблизи границы раздела фаз (проще говоря, у поверхности частицы).

Кстати, вместо частиц, функцию дисперсной фазы может взять на себя любая развитая граница раздела фаз - пористая перегородка, поверхность сорбента, наконец, поверхность стекла, любой капилляр и т.п.

Будучи помещенными в электрическое поле дисперсионная среда и дисперсная фаза начинают на поле реагировать относительным движением происходят "ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ".

ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИМИ ЯВЛЕНИЯМИ называются движения дисперсной фазы относительно дисперсионной среды под влиянием электрического поля, либо ОБРАТНОЕ ЯВЛЕНИЕ - возникновение разности потенциалов между дисперсной фазой и дисперсионной средой при наличии разностей гидростатического давления или градиента силы тяжести. проще говоря, если частицы оседают, то между верхним и нижним слоями суспензии возникает разность потенциалов ("ПОТЕНЦИАЛ СЕДИМЕНТАЦИИ").

Электрокинетические явления можно разделить на 4 типа:

1. Эффект Дорна [ Dorn, 1878 ] (возникновение потенциалов седиментации).

2. Обратный эффект [ Quinke, 1859 ] (возникновение потенциалов течения - при протекании жидкости через пористую перегородку появляется разность потенциалов поверхности перегородки относительно вытекающей жидкости).

3. Электроосмос [ Ф.Рейс, 1807 ] - движение дисперсионной среды в постоянном электрическом поле по направлению к электроду, заряженному одноименно с частицами дисперсной фазы.

4. Электрофорез [ Ф.Рейс, 1807 ] - движение частиц дисперсной фазы в постоянном электрическом поле по направлению к противоположно заряженному электроду.

Настоящая задача практикума посвящена использованию только одного из перечисленных явлений - электрофорезу.

Все электрокинетические явления так или иначе связаны с возникновением разности потенциалов, между дисперсионной средой и дисперсной фазой.

Возникновение потенциала на границе двух фаз всегда связано с наличием на поверхности раздела электрического заряда. Природа заряда может быть различной :

1. на поверхности частицы имеются ионогенные группы. Ионизация этих групп, приводит к тому, что одни ионы ("противоины") уходят в дисперсионную среду, а другие ("потенциалобразующие ионы") остаются фиксированными на поверхности частиц дисперсной фазы и оказываются ответственными за знак ее потенциала.

2. на поверхности частицы не имеется ионогенных групп. В этом случае потенциал образуется за счет адсорбции ионов из среды. Преимущественно адсорбируются анионы, поскольку они менее гидратированы и их адсорбция термодинамически выгоднее, нежели катионов. Таким образом, в любом случае на границе раздела фаз происходит разделение зарядов или ассиметричное распределение ионов. Ионы одного знака прочно связаны с поверхностью частицы, а ионы противоположного знака находятся уже в дисперсной среде. В целом, получилась электрически нейтральная система ДВОЙНОЙ ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ СЛОЙ.

Структура двойного электрического слоя не зависит от механизма возникновения заряда на поверхности частицы, но она зависит от плотности заряда на поверхности частицы. Если слой заряда достаточно неплотный - вокруг каждого заряда поверхности образуется своя ионная атмосфера, если слой заряда достаточно плотный - происходит обобществление ионных атмосфер вплоть до образования истинного двойного слоя.

Существует целая группа теорий строения двойного слоя, интересующимся можно посоветовать обратиться к специальной литературе, или хотя бы прочитать учебник по биофизике.

Как известно каждому студенту из курса коллоидной химии, в грубом приближении, двойной электрический слой имеет следующее строение (рис.1): Во-первых если система в устойчивом состоянии, двойной слой полностью электрически нейтрален - вся совокупность поверхностного электрического заряда частицы полностью экранирована зарядом совокупности противоинов. Но совокупность противоинов не однородна: на молекулярном расстоянии от границы раздела фаз находится слой потениалобразующих ионов с некоторым количеством противоинов (плотный слой Гемгольца). Взаимодействие названной части противоинов с потенциалобразующим слоем носит характер адсорбционного взаимодействия, поэтому этот (достаточно плотный) слой противоинов называется АДСОРБЦИОННЫМ СЛОЕМ.

Если вследствие каких-то причин дисперсионная фаза начинает двигаться относительно дисперсной среды, то адсорбционный слой противоинов всегда движется вместе с дисперсионной фазой (попросту вместе с диспергированными частицами). Остальная часть противоинов, образующая рыхлый ДИФФУЗИОННЫЙ СЛОЙ, останется в дисперсионной среде.

Рис.1. Схема строения двойного слоя

Полная разность потенциалов (Е) между дисперсной фазой и дисперсионной средой называется ПОЛНЫМ ЭЛЕКТРОТЕРМОДИНАМИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ.

Разность потенциалов (  - дзета-потенциал) между адсорбционным слоем и дисперсионной средой называется ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ ( его можно определить по подвижности частиц в электрическом поле, потому и назвали электроКИНЕТИЧЕСКИЙ. В некоторых руководствах ошибочно утверждается, что он появляется только при движении частицы). Дзета-потенциал всегда меньше электротермодинамического потенциала, и это уменьшение обусловлено экранирующим действием противоинов адсорбционного слоя (рис.2).

Любые факторы, влияющие на строение двойного электрического слоя, изменяют величину z-потенциала. При увеличении концентрации ионов в дисперсной среде (см. также ИОННУЮ СИЛУ РАСТВОРА) толщина диффузионного слоя уменьшается и уменьшается -потенциал. Если двойной электрический слой возникает в результате диссоциации ионогенных групп, то величина электро кинетического потенциала в большой степени может зависеть от РН дисперсионной среды. Меняя РН - можно менять и потенциал вплоть до нуля и даже до смены знака заряда частицы.

Величина электрокинетического потенциала в большой степени может зависеть от РН дисперсионной среды. Меняя РН - можно менять и потенциал вплоть до нуля и даже до смены знака заряда частицы.

Электрокинетический потенциал возникает на очень коротком расстоянии и, поэтому, не может быть измерен прямым "ЭЛЕКТРОДНЫМ" способом.

Величину -потенциала определяют косвенно, расчетным путем из скорости движения фаз в электрическом поле.

Для частиц большого размера (относительно толщины двойного электрического слоя - 0.1 - 0.5 нм) применимо соотношение Смолуховского, иногда именуемое уравнением Гельголца - Смолуховского (иногда, ошибочно, Ейнштейна - Смолуховского):

где:  - вязкость дисперсионной среды (Па.с)

 - скорость движения частицы (метр/секунда)

 - диэлектрическая проницаемость дисперсионной среды (б/разм.)

₀ - диэлектрическая постоянная (Ф/м)

Е - градиент потенциала внешнего электрического поля (Вольт/метр).

 - электрокинетический потенциал (Вольт)

2. ПРИМЕНИТЕЛЬНО К КЛЕТКАМ.

Представление клетки как квазиколлоидной частицы, имеющей поверхность (мембрану) частично проницаемую для ионов, позволяет, на основании теории Гуи-Чепмэна, определять поверхностный заряд через электрокинетический потенциал клетки. Для клеток диаметром более 10 -6м (больше микрона) ,при ионной силе раствора выше 0.01, поверхностный заряд (  ) c точностью до 1% (!) можно определить по формуле Тэнфорда (1970):

??????????????????????????????????????????????????

ОТСУТСТВУЮТ 3 СТРАНИЦЫ

??????????????????????????????????????????????????

данном случае обусловлен адсорбцией ионов из дисперсионной среды полисахаридами поверхности. Электрофоретическая подвижность таких клеток практически не зависит от РН среды.

Однако такое деление оказывается довольно условным, так как свойства поверхности бактериальных клеток могут изменяться при изменении внешних условий существования. Так, например, z-потенциал золотистого стафилококка при обычных условиях культивирования остается постоянным при большом изменении РН среды. Если же бактерии культивируются в среде, богатой глюкозой, то наблюдается зависимость z-потенциала от величины РН. Это, по мнению многих авторов, следствие накопления на поверхности клеток ионогенных групп белковой природы.

Таким образом, метод электрофореза является хорошим средством изучения электрохимических свойств биологических поверхностей: способности к ионизации и способности к адсорбции молекул и ионов.

3. ПРИНЦИП ИЗМЕРЕНИЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕЧСКОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛЕТОК.

Для определения электрокинетического потенциала частиц имеющих размеры порядка 10 -5м измеряют скорость движения частиц в однородном электрическом поле с известной напряженностью. По полученным значениям скорости - " электрофоретической подвижности", с помощью формулы Эйнштейна-Смолуховского вычисляют значение электрокинетического потенциала.

При работе с частицами указанного размера возможно наблюдение за их подвижностью с помощью микроскопа, следовательно проводить измерение для отдельно взятой частицы.

Такой способ определения электрофоретической подвижности называют МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ , в отличие от макроэлектрофореза, где следят за подвижностью всех частиц вместе по движению границы плотной суспензии в электрическом поле.

Если провести измеренная достаточное большое число раз, то можно найти также различные параметры распределения частиц в суспензии по электрокинетическому потенциалу.

ТРУДНОСТИ. Невозможно наблюдать за отдельной частицей, если частиц слишком много - поэтому суспензию необходимо разбавлять до " удобной" концентрации. Невозможно наблюдение в толстом слое жидкости, поэтому измерение проводят в капилляре, лучше всего в плоском капилляре.

Измерению мешают: всякого рода поляризационные эффекты вызванные прохождением электрического тока через электролит, которым является дисперсионная среда, оседание частиц, адгезия частиц на стенках капилляра, пристеночное движение дисперсионной среды в сторону обратную движению частиц (электроосмос). Вследствие последнего вблизи стенок имеют место вихреообразные движения частиц и т.п.

Все это искажает результаты измерений. Как со всем этим бороться?

• Удачной конструкцией измерительной камеры (камера - это, где в электрическом поле должны плавать клетки).

• Обработкой стенок камеры веществами препятствующими адгезии клеток (например, силиконирование) или выбором материала камеры.

• Выбором удачной зоны для наблюдения внутри капиллярного пространства камеры.

• Постоянной сменой полярности внешнего электрического поля и достаточно высоким числом повторных измерений для надежного усреднения результата.

4. АППАРАТУРА ( ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ УСТАНОВКА).

4.1. Функциональная схема (блок-схема) установки. Независимо от конструкции измерительной камеры , устройство для измерения должно состоять из (рис.3): регулируемого в широких пределах источника стабилизированного напряжения, высокоомного измерителя разности потенциалов (вольтметра), таймера, пульта управления, измерительного микроскопа и камеры с электродами.

Рис.3. Блок-схема установки для микроэлектрофореза клеток.

1- регулируемый источник стабилизированного постоянного напряжения.

2- таймер.

3- пульт управления:

3а- переключатель полярности внешнего напряжения,

3b- пусковой ключ.

4- высокоомный вольтметр

5 - камера:

5а- ванны с электролитом и электродами,

5b- измерительный капилляр.

6- микроскоп с окулярной сеткой

7- осветитель микроскопа.

8- рабочие электроды.

9- измерительные электроды.

КАМЕРА. Особого внимания заслуживает описание конструкции камеры.

В литературе описано довольно много камер для измерения электрокинетического потенциала клеток и других частиц. Однако, для целей практикума в Ветеринарной академии подходит не всякая конструкция: камера должна быть проста в эксплуатации, трудно ломаема, состоять из легко заменяемых деталей. Поэтому описанная ниже камера, по своей конструкции несколько отличается от камер для микроэлектрофореза клеток промышленных образцов.

Электрофоретической камерой служит плоская горизонтальная камера на базе счетной камеры Фукса-Розенталя (рис.4).

Рис.4. Устройство модернизированной счетной камеры Фукса -Розенталя.

1- продольная прорезь средней площадки.

1а- расширения продольной прорези.

2- крайние поперечные прорези.

Продольная прорезь (1) в средней площадке была расширена до крайних поперечных прорезей (2). Плоский горизонтальный капилляр в котором производится измерение образуется между поверхностями измерительных площадок счетной камеры и покровным стеклом.

Модернизированная счетная камера Фукса-Розенталя вклеена пицеином (10) в оправу из органического стекла (5) (рис.5). В связи с отсутствием в МВА (МГАВМиБ) шлифованных покровных стекол, для камеры используется обычное покровное стекло. Плотность прижима обеспечивается теперь не "притиранием до ньютоновых колец", а пружинящими тефлоновыми прокладками always+ (14). В оправе имеются колодцы (12), глубиной 6мм, в которых помещаются плоские платиновые электроды (8). С помощью специальных канавок (11), электроды (8) соединены с крайними поперечными прорезями (2) камеры. Во время работы колодцы и канавки заполняются электролитом и выполняют функцию электролитических ключей. Во внутренних поперечных канавках (15) находятся измерительные платиновые электроды (9) игольчатого типа, которые также выполняют функцию повышения однородности электрического поля в измерительном капилляре. Возникновению больших шунтирующих капилляр токов препятствует изолирующая перегородка (13) в центральной продольной канавке (1).

Рис.5. Устройство камеры для микроэлектрофореза клеток (вид сверху). Камера установлена на предметном столике микроскопа.

5- оправа из орг.стекла.

8- рабочие электроды.

9 измерительные электроды.

10- пицеиновая прослойка.

11- канавки от колодцев к прорезям камеры.

12- колодцы для рабочих электродов.

13 изолирующая перегородка.

Измерительные электроды подключены к высокоомному вольтметру (2) типа В7-26, переключение полярности вольтметра происходит автоматически. Плоские платиновые электроды (8) через коммутирующее устройство (4) подключены к стабилизированному источнику питания (1) типа Б5-50.

Вся камера находится на предметном столике микроскопа. Микроскоп снабжен конденсором ОИ-10, что позволяет вести наблюдение как в светлом, так и темном поле. Последнее удобно при наблюдении таких объектов как тромбоциты или тени эритроцитов и т.п. Окуляр микроскопа снабжен шкалой (может быть окулярная сетка) для отсчета расстояния пройденного клетками.

5. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ.

1. Подготовка камеры.

ПОМЫВКА КАМЕРЫ. Снять покровное стекло, камеру тщательно промыть дистиллированной водой, при необходимости спиртом. Рабочие поверхности камеры должны быть полностью очищены от частиц грязи, жировых пятен и т.п. Иногда это удобно делать с помощью кусочка марли намотанного на глазной пинцет, иногда полезно воспользоваться фильтровальной бумагой.