14 Исследование динамики гемолиза методом турбидиметрии метод кислотных эритрограмм

Новиков В.Э.

Практикум

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

ТУРБИДИМЕТРИЯ И НЕФЕЛОМЕТРИЯ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ

Задача № 3

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ГЕМОЛИЗА МЕТОДОМ ТУРБИДИМЕТРИИ.

МЕТОД КИСЛОТНЫХ ЭРИТРОГРАММ

методические указания

2001

В настоящее время в практике лабораторных клинических исследований турбидиметрический метод анализа используют для определения концентрации клеток в суспензиях, а особенно - свойств клеток - по динамике их разрушения или взаимодействия: механической (ультразвуковой) резистентности эритроцитов, лейкоцитов, кровяных пластинок, сперматозоидов; кислотной, тепловой, осмотической резистентности эритроцитов; агрегационной способности кровяных пластинок и эритроцитов. На занятии студенты познакомятся с применением турбидиметрии на примере регистрации динамики кислотного гемолиза.

Цель занятия - познакомиться с применением оптического метода турбидиметрии для исследования свойств клеток в суспензиях, освоить метод кислотных эритрограмм, познакомиться практически с универсальным лабораторным аналоговым модулем.

Цель измерения - зарегистрировать кривую динамики кислотного лизиса эритроцитов (кислотную эритрограмму). Точнее - семейство эритрограмм (3 – 5 кривых).

Задание

1. Ознакомиться с принципом работы измерительной установки - автоматического регистрирующего турбидиметра , ее устройством, подготовить турбидиметр к работе.

2. Зарегистрировать эритрограмму (контроль).

3. Предъявить эритрограмму преподавателю и получить ЗАДАНИЕ.

4. Подготовить эритрограммы к машинной обработке.

5. Произвести машинную обработку кривых.

6. Произвести обработку результатов.

7. Оформить отчет.

Примеры типовых ЗАДАНИЙ:

1. Исследовать зависимость кинетики гемолиза от концентрации гемолитика.

2. Исследовать зависимость кинетики кислотного гемолиза от величины осмотического давления.

3. Исследовать изменение распределения клеток в популяции под действием физического фактора (распределение по устойчивости к гемолитику).

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАДАНИЮ .

1. Физические принципы турбидиметрии клеточных суспензий.

ЧТО ТАКОЕ ВЕЛИЧИНА ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКОГО ОСЛАБЛЕНИЯ И КАК ЕЕ ОПРЕДЕЛЯТЬ.

Турбидиметрическим методом анализа (турбидиметрией) называют метод, основанный на измерении интенсивности света, прошедшего через светорассеивающую (мутную) среду, например, суспензию клеток. Интенсивность прошедшего через мутную среду света в общем случае зависит от светорассеяния и поглощения. При турбидиметрических измерениях поглощение стараются исключить соответствующим выбором длины волны падающего света. Например, при исследовании суспензии эритроцитов используют свет с длиной волны не менее 750 нм (красный и ближний инфракрасный).

Интенсивность света, прошедшего через мутную среду сравнивают с интенсивностью падающего света (рис.1).

Рис.1 Ослабление света при прохождении через мутную среду вследствие светорассеяния.

I₀ - интенсивность падающего света.

I - интенсивность прошедшего света.

1 - эритроцит;

2 - кювета с суспензией эритроцитов.

При турбидиметрическом анализе клеточных суспензий, по отношению интенсивностей I и I₀ можно оценить концентрацию клеток по формуле:

(1)

где: N - концентрация клеточных тел [кл/мл];

 - коэффициент турбидиметрического ослабления одной клетки;

величину а можно легко определить экспериментально - построением калибровочной зависимости для каждого типа клеток, при каждой из используемых длин волн.

Выражение (1) формально соответствует выражению закона Ламберта-Бэра:

(2)

или

где: D - оптическая плотность раствора

(3)

C - концентрация раствора

L - длина кюветы

 коэффициент молярной экстинкции

К = L * 

Закон Ламберта-Бэра утверждает линейность зависимости оптической плотности раствора от концентрации поглощающего вещества.

В случае, если свет падает не на поглощающую среду, а на светорассеивающую вместо величину аналогичную оптической плотности называют турбидиметрическим ослаблением среды или кажущейся оптической плотностью ("D"). Линейность зависимости турбидиметрического ослабления от концентрации светорассеивающих частиц, следствием которой является выражение (1), выполняется только до определенной концентрации рассеивающих частиц. Как только концентрация светорассеивающих частиц начинает превышать ГРАНИЦУ ОДНОКРАТНОСТИ СВЕТОРАССЕИВАНИЯ, зависимость "D" от N перестает быть линейной.

Светорассеяние однократно, если свет рассеянный любой частицей данной суспензии ни на какую другую частицу суспензии уже не попадает, равно как он не попадает и на детектор света, стоящий на пути прямого светового потока.

Для крупных частиц, таких как эритроциты закономерности светорассеяния подчиняются законам геометрической оптики, поэтому граница однократности светорассеяния, в сфероидном приближении, может быть определена из соотношения:

(13)

где N_кр - концентрация клеточных тел в точке перегиба зависимости "D" от N (рис.3)

R - средний радиус частиц в суспензии

Рис.2 примерный график зависимости величины турбидиметрического ослабления суспензии от концентрации клеточных тел, при фиксированной длине волны падающего света.

Для большинства клеточных суспензий требование однократности светорассеяния удовлетворительно выполняется если величина турбидиметрического ослабления суспензии не превышает 0.4.

Если концентрация клеток в суспензии изменяется, непрерывная регистрация интенсивности I при неизменной величине I₀, позволяет определить относительное изменение концентрации клеток и без предварительной калибровки (то есть не требуется знание величины  ). В данной работе студентам предлагается именно такой вариант.

2. ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ УСТАНОВКА (автоматический турбидиметр).

Измерительная установка собрана из стандартных блоков (рис.3)

Рис.3. Блок-схема турбидиметра с аналоговой регистрацией.

1 - источник света

2 - светофильтр

3 - кювета с образцом

4 - фотодетектор

5 - усилитель постоянного тока

6 - электроизмерительный прибор

7 - регистратор (самопишущий потенциометр

8 - корпус КФК2

9 - привод мешалки

Основным узлом является фотоэлетроколориметр (ФЭК) типа КФК-2 (рис.3),где проводится основное оптическое измерение - определение турбидиметрического ослабления образца и преобразование этой величины в электрический сигнал. Остальные блоки - усилитель (конструктивно он внутри корпуса КФК) и регистратор - служат для непрерывной записи сигнала на диаграммной ленте.

Свет от источника (1) проходит через светофильтр (2), который выделяет определенную спектральную область (кровь, эритроциты - светофильтр на 750 или 870 нм - красный или "ближний" инфракрасный). Далее свет проходит через кювету с образцом (3) и попадает на фотодетектор (4), который преобразует падающий на него свет в электрический сигнал.

Величину сигнала после усиления (5) измеряют электроизмерительным прибором (6), параллельно которому подключен самопишущий потенциометр типа КСП-4 (7).

На шкале электроизмерительного прибора (6) нанесены отметки (Рис.4) соответствующие величинам светопропускания (линейная шкала Т от 0 W до 100% ) и оптической плотности (логарифмическая шкала D - от  до 0).