Лабораторна робота № 1.1

Визначення величини популяції мікроорганізмів

Мета роботи – ознайомитися із методами визначення кількості мікроорганізмів.

Основні завдання роботи

1. Ознайомитися із методами визначення кількості мікроорганізмів.

2. Ознайомитися із устроєм лічильних камер.

3. Підрахувати кількість дріжджових клітин в суспензії, використовуючи камеру Горяєва (або Бюркера).

4. Визначити концентрацію клітин на денситометрі.

5. Визначити кількість клітин висівом на тверде поживне середовище.

Основні теоретичні відомості

Про ріст мікроорганізмів у природних субстратах або в поживних середовищах судять по кількості їхніх клітин або біомасі в одиниці об’єму. Методи визначення цих показників можуть бути прямими (підрахунок клітин під мікроскопом, зважування на вагах) або непрямими. Непрямі методи засновані на вимірі параметрів, величина яких залежить від кількості або біомаси мікроорганізмів (число колоній, що виросли після висіву суспензії клітин на поживне середовище, розсіювання або поглинання суспензією клітин світла й ін.). Вибір методу залежить від мети дослідження, властивостей поживного середовища або субстрату, а також особливостей росту й морфології мікроорганізмів. Багато методів, які використовуються для визначення числа одноклітинних мікроорганізмів, не прийнятні при підрахунку багатоклітинних (нитчастих, міцеліальних і ін.) форм.

При оцінці чисельності мікроорганізмів, особливо в природних субстратах (насамперед у ґрунті), необхідно пам’ятати, що їхні клітини часто перебувають у прикріпленому (адгезованому) стані або у вигляді мікроколоній. Тому перед початком підрахунку їх потрібно відокремити від часток субстрату й один від одного (десорбувати). Вибір методу десорбції (механічне перемішування суспензії клітин, розтирання, обробка ультразвуком, застосування поверхово–активних речовин і т.д.) визначається особливостями досліджуваного субстрату.

1. Підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом

Рис. 1. Лічильна камера Горяєва-Тома: А - вид зверху;

Б - вид збоку; В - при малому збільшенні мікроскопа

Порахувати клітини мікроорганізмів під мікроскопом можна, використовуючи лічильні камери, капіляри Перфільєва, препарати фіксованих і пофарбованих клітин, приготовлені на предметних скельцях або мембранних фільтрах. Перераховані методи дозволяють визначити загальну кількість клітин в одиниці об’єму. Варто пам’ятати, що підраховуються всі клітини, як живі, так і мертві. Основне обмеження більшості зазначених методів – необхідність досить високих концентрацій клітин в одиниці досліджуваного субстрату.

Підрахунок клітин у лічильних камерах.

Цей метод рекомендується використовувати для підрахунку великих об’єктів – дріжджів, одноклітинних водоростей, конідій грибів і деяких бактерій. Зазвичай використовують камеру Горяєва – Тома (рис. 1), хоча можна застосовувати й інші лічильні камери. Камера Горяєва являє собою товсте предметне скло, розділене борозенками. На центральну частину скла нанесена сітка. Площа квадрата сітки зазначена на одній зі сторін предметного скла й відповідає 1/25 мм² (великий квадрат) або 1/400 мм² (малий квадрат).

Частина предметного скла, на якій нанесена сітка, на 0,1 мм нижче двох інших сторін. Це глибина камери; вона завжди вказується на предметному склі.

При роботі з камерою необхідно дотримуватися певного порядку її заповнення. Спочатку поглиблення із сіткою покривають спеціальним шліфованим покривним склом і, злегка притискаючи, зміщають покривне скло в протилежні сторони до появи кілець Ньютона. Це вказує на те, що покривне стекло притерте до сторін камери. Тільки при такій умові об’єм суспензії мікроорганізмів, що перебуває в камері, відповідає розрахунковому. Після цього камеру заповнюють досліджуваною суспензією мікроорганізмів. Суспензію вносять через борозенку камери капіляром або піпеткою. Підрахунок клітин рекомендується починати через 3–5 хв після заповнення камери, щоб клітини осіли й при мікроскопуванні їх було видно в одній площині.

Число клітин підраховують із об’єктивом х8 або х40. З імерсійним об’єктивом працювати не можна, тому що його фокусна відстань менше товщини скла камери. Зазвичай підраховують клітини мікроорганізмів в 10 великих або 20 маленьких квадратах сітки, переміщаючи останні по діагоналі. Враховують всі клітини, що лежать у квадраті сітки, а також клітини, що перетинають верхню й праву сторони квадрата. При підрахунку кількість клітин у великому квадраті не повинна перевищувати 20, а в малому – 10, у противному випадку вихідну суспензію розводять водопровідною водою. Для одержання достовірного результату загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинне бути не менше 600.

Точність визначення залежить від того, наскільки щільно пришліфоване покривне скло до поверхні камери, тому підрахунок клітин повторюють 3–4 рази, щоразу заново монтуючи камеру й заповнюючи її досліджуваною суспензією мікроорганізмів. Це забезпечує більшу точність, ніж підрахунок 600 клітин при однократному монтажі камери. Кількість клітин в 1 мл досліджуваній суспензії обчислюють по формулі (1)

(1)

де М – число клітин в 1 мл суспензії; а – середнє число клітин у квадраті сітки; h – висота камери в мм; S – площа квадрата сітки в мм²; 10³ – коефіцієнт перекладу см³ у мм³; n – розведення досліджуваної суспензії.