Розділ 7

ТЕОРЕТИЧНІ ОСНОВИ БЕЗПЕРЕРВНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ДРІЖДЖІВ ТА СПИРТОВОГО БРОДІННЯ

НАКОПИЧЕННЯ БІОМАСИ ДРІЖДЖІВ

Розмноження - це відтворювання нових клітин шляхом брунькування. Спо­живаючи живильні речовини, клітина синтезує складні сполуки усього організму. Розмножуватися клітини можуть і за відсутності росту. У несприятливих умовах розмноження клітин припиняється, але зростання їх продовжується , вони досяга­ють великих розмірів, витягуються у довжину, що є ненормальним явищем.

При розгляді закономірностей розмноження і росту клітин використовують терміни швидкість і ріст клітин дріжджів, вкладаючи у це поняття інтенсивність утворення клітин чи біомаси.

Про розмноження дріжджів дізнаються із збільшення чисельності клітин, а про ріст - вимірюючи їх розміри.

При періодичному способі культивування швидкість розмноження дріжджів має такі фази росту. Дріжджові клітини у рідкому живильному середовищі почина­ють розмножуватися не спочатку, а через деякий час. У цей період клітини присто­совуються до зовнішнього середовища, діють на нього ферментами і перетворю­ють складні компоненти у прості, які здатні дифундувати у клітини.

Проміжок часу, протягом якого посіяні у середовище дріжджові клітини ще не почали розмножуватися, зветься лаг-фазою.

Після лаг-фази клітини починають рости, розміри їх збільшуються, утворю­ються бруньки - починається період розмноження дріжджів. Через проміжок часу, який зветься тривалістю генерації, кількість клітин і їх біомаса подвоюється. У цей період розмноження дріжджів відбувається з постійною питомою швидкістю. При цьому кількість клітин і їх маса збільшуються у геометричній прогресії. Період швидкого розмноження клітин зветься логарифмічною або експоненціальною фа­зою, тому що у рівнянні, яке описує питому швидкість розмноження культури, роз­мір часу стоїть у показнику ступеня (експонента). Якщо кількість клітин або їх біомасу виразити у логарифмах, то залежність приросту клітинної маси від часу зображається прямою похилою лінією. У цей період клітини найбільш активні , молоді, швидко брунькуються.

З виснажуванням середовища розмноження дріжджів уповільнюється, при­ріст клітин зменшується - наступає фаза сповільнення, яку називають також фазою від'ємного прискорення росту. При цьому питома швидкість розмноження по­ступово знижується.

137

Із зменшенням вмісту поживних речовин у середовищі розмноження дріжджів зовсім припиняється і настає стаціонарна фаза. Кількість клітин і біомаси не змі­нюється. Уся клітинна популяція знаходиться у кінцевій стадії свого розвитку.

Через деякий час кількість клітин і біомаси починає зменшуватися. Вичерпав­ши середовище, клітини для підтримання життя використовують власні резервні речовини. Настає фаза старіння і відмирання культури під дією метаболітів і авто-літичних процесів, які супроводжуються розпадом клітин. Усе це призводить до зменшення біомаси - крива росту ухиляється донизу.

Характер кривої росту дріжджів зумовлений якістю середовища, фізіолого-біохімічними особливостями культури дріжджів і умовами їх культивування. Ці фактори можуть змінити вигляд кривої. Але послідовність фаз залишається.

Збільшення концентрації біомаси від Хо до X характеризується абсолютною (валовою) і максимальною відносною (питомою) швидкістю її розмноження.

Середня валова швидкість росту V_cep за час визначається з рівняння

Найбільша швидкість розмноження (константа росту) визначається з рів­няння геометричної прогресії

де е - основа натуральних логарифмів, яка дорівнює 2,3 після логарифмування дорівнює

Для визначення треба дослідним шляхом встановити приріст біомаси у експоненціальній фазі при найбільшій швидкості розмноження на середовищі з над­лишком живильних речовин.

Валова швидкість розмноження характеризує збільшення біомаси в абсолют­них величинах; питома швидкість - це приріст мікроорганізмів, які утворилися з одиниці їх кількості в одиницю часу, і має розмірність

Між швидкістю розмноження і максимальною питомою швидкістю розмно­ження .є таке співвідношення

де - кількість брунькувань кожної клітини за одиницю часу, або Швидкість розмноження можна виразити співвідношенням

де - середня тривалість генерації клітин, тобто подвоєння їх кількості або маси.

138

Швидкість розмноження мікроорганізмів пропорційна, але не дорівнює максима­льній швидкості розмноження Якщо число клітин збільшується удвічі за 2 год

Визначивши цей час, можна за цим рівнянням розрахувати

дріжджових клітин досягається тоді, коли вони розвиваються в оптима­льному за складом живильному середовищі Й у ньому відсутні інгібітори. - це суто математичний, ніколи не досяжний рівень швидкості розмноження мікроорга­нізмів. У реальних умовах дріжджі розмножуються не завжди в оптимальних умо­вах і середовищі. Тому крім розрізняють ще реальну питому швидкість роз­множення - вона може досягнути 90%

Вивчення кривої росту в експоненціальній фазі при періодичному процесі стало обґрунтуванням для математичного опису безперервного процесу культивування мікроорганізмів.

Питома швидкість розмноження залежить від концентрації субстрату чи від­повідних речовин, які у даних умовах є лімітуючим фактором. Термін лімітуючий фактор включає у себе фактор живлення чи інші фактори, які впливають на Моно і незалежно від нього Новик і Сцилард показали, що між питомою швидкіс­тю розмноження і концентрацією живильних речовин є така залежність

де S - концентрація лімітуючої ріст поживної речовини, яка знаходиться у мініма­льній кількості, г/л; Ks -константа насичення, яка чисельно дорівнює концентрації живильної речовини, при якій швидкість розмноження досягає половини максима­льної

Між концентрацією живильної речовини у середовищі і швидкістю розмно­ження дріжджів існує залежність, яка описується рівнянням, аналогічним рівнян­ню Міхаеліса-Ментена, що характеризує зв'язок між концентрацією субстрату і швидкістю ферментативної реакції. Різниця у тому, що якщо остання проходить при постійній кількості ферменту, то процеси росту клітин супроводжуються збі­льшенням кількості дріжджів, а отже і кількості ферментів.Тому у рівнянні Моно абсолютна швидкість процесу замінена відносною, тобто швидкістю розмноження перерахованою на одиницю зростаючої біомаси

Це рівняння достатньо точно описує кінетику росту дріжджів у дріжджогене-раторах і головних апаратах бродильної батареї, коли концентрація інгібітора рос­ту спирту невелика. Якщо з одночасним розмноженням дріжджів відбувається спир­тове бродіння, продукти, які при цьому утворюються, гальмують розмноження клі­тин. Залежність питомої швидкості розмноження від концентрації продуктів бро­діння описується рівнянням Ієрусалимського

139

де - питома швидкість розмноження за відсутності продуктів бродіння; Кр-

константа, яка дорівнює концентрації продуктів бродіння, при якій питома швид­кість розмноження уповільнюється вдвічі; Р-фактична концентрація цих продуктів.

Однак дослідження УкрНДІСПу показали, що дріжджові клітини досить доб­ре розмножуються і при відносно високих концентраціях спирту в середовищі (6-8 об. %), якщо у ньому відсутні такі лімітуючі фактори, як вміст фосфорного та азот­ного живлення дріжджів, вміст стимуляторів росту, наявність інгібітор і в. Отже, при безперервному зброджуванні крохмалемістких і мелясних середовищ основ­ним фактором, який лімітує розмноження клітин, є вміст живильних речовин у се­редовищі, яке зброджується, а не утворення і накопичення у ній спирту.

Питома швидкість розмноження дріжджів залежить також від таких факторів: тривалості перебування клітин у середовищі, швидкості розведення середовища в апараті, температури і рН середовища, осмотичного тиску, активності культури, концентрації клітин у середовищі, концентрації метаболітів, наявності біостиму-ляторів і інгібіторів росту та ін.

Для гомогенно-безперервного культивування дуже важливим показником є швидкість розведення середовища D, тобто швидкість обміну середовища у дріж-джовирощувальному апараті. D показує, яка частка корисного об'єму апарата за­повнюється свіжим середовищем протягом 1 год:

де F - швидкість притоку середовища в апарат, м³/год; Vp - робочий об'єм апа­рата, м³.

При безперервному процесі притік середовища у апарат дорівнює відтоку його з апарата.

Оскільки миттєвий приріст біомаси дріжджів компенсується виносом її з використаним середовищем DX, то стійкий стан процесу визначається залежністю

Це рівняння визначає основну закономірність гомогенно-безперервного спо­собу культивування мікроорганізмів. Коли то сталий режим порушується, дрі­жджові клітини вимиваються з апарата, концентрація їх зменшується, поживні речо­вини як слід не використовуються і втрати їх з відтоком збільшуються. З підвищен­ням концентрації середовища процес стабілізується на новому рівні при більш високій концентрації середовища і меншій концентрації дріжджів. Навпа­ки, при уповільненому розведенні час перебування клітин у апараті збільшується, поживні речовини повніше засвоюються, кількість клітин стає більшою, знижу-

140

Теоретичні основи безперервного культивування дріжджів та спиртового бродіння

ється і процес стабілізується на іншому режимі. При безперервному культивуванні мікроорганізмів система автостабілізується.

Час перебування середовища в апараті (оберт апарата) т є величиною, яка зво­ротня D;

При гомогенно-безперервному культивуванні дріжджів продуктивність апара­та дорівнює

Концентрацію біомаси дріжджів X при сталому безперервному процесі ви­значають за рівнянням

X = Y(S₀-S),

де Y - вихід біомаси дріжджів з живильних речовин, економічний коефіцієнт; S₀ -концентрація живильних речовин у проточному середовищі; S - концентрація жи­вильних речовин у відходному середовищі.

Найбільш істотним недоліком безперервного розмноження мікроорганізмів є розвиток у середовищі сторонньої мікрофлори, головним чином- бактерій. Сторон­ні мікроорганізми не тільки потребують тих самих поживних речовин, що і дріж­джі, але і виділяють у середовище продукти свого обміну, які пригнічують життєді­яльність дріжджових клітин. Вихід біомаси зменшується.

Розвиток сторонніх мікроорганізмів підпорядковується таким же закономір­ностям, що і дріжджових клітин.

Якщо швидкість розведення середовища більша максимальної питомової швид­кості розмноження сторонніх мікроорганізмів, вони вимиваються із дріжджогене-раторів. При вони затримуються в ньому, концентрація їх зростає.

Коли сторонні мікроорганізми весь час надходять із свіжим середовищем, вони ніколи не можуть бути вимиті з апарата. У цьому випадку притік і ріст дріжджів будуть перевищувати відтік.

НАКОПИЧЕННЯ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ

Процес зброджування цукрів підпорядковується закону мономолекулярної ре­акції, константа швидкості якої виражається рівнянням

де С₀ і С - концентрація зброджуваних цукрів на початку бродіння і через трива­лість часу

Фізичне розуміння К - витрати цукру за 1 год.

141

Тривалість бродіння визначається за рівнянням

Як при кожній мономолекулярній реакції, процес зброджування може бути характеризовано часом напіврозпаду - часом, за який вихідна кількість цукрів зме­ншиться вдвічі (С=0,5Со). Тоді т буде дорівнювати

Величина К залежить від концентрації дріжджів у середовищі, фізіологічної активності дріжджів, складу середовища, яке зброджується, температури бродіння та інших зовнішніх факторів.

Контрольні питання і завдання

1. Технологія і математичний опис накопичення біомаси дріжджів і спирту.

2. Продуктивність дріжджобродильних апаратів.

142