Выявление бактерий кокковой группы

Наличие на чашках с МПА мелких прозрачных или слегка мутноватых колоний, образующих иногда различные пигменты, дает основание предположить присутствие возбудителей кокковых инфекций (диплококкоз, стафилококкоз, стрептококкоз).

Дифференциальный диагноз ставят на основании микроскопического исследования (грамположительные, неподвижные, неспорообразующие круглые клетки, располагающиеся одиночно, цепочками, гроздями, в виде ланцетовидных диплококков), а также определения характера роста на питательных средах. На МПБ стафилококки и диплококки дают равномерное помутнение, на дно пробирки выпадает осадок. При росте стрептококков в МПБ с 2% глюкозы бульон остается прозрачным, а на дно пробирки выпадает осадок. Патогенность стафилококков определяют реакцией коагулирования плазмы крови. Для этой цели берут 2 пробирки с плазмой крови кроликов. В одну из них бактериологической петлей вносят суточную агаровую культуру испытуемого стафилококка и тщательно перемешивают. Другая пробирка является контрольной. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Результаты реакции учитывают через 2-4 и 24 ч. Штаммы стафилококка, продуцирующие фермент плазмокоагулазу, свертывают плазму, вследствие чего она превращается в студнеоб­разную массу. Положительная реакция указывает на наличие в мясе патогенных стафилококков.

Методы обнаружения анаэробов

Сущность выявления анаэробов заключается в определении их морфологии, способности расти на питательных средах в отсутствие кислорода воздуха и установлении патогенное заражением лабораторных животных.

Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидких питательных средах, в которых используют печень и мясо в качестве восстановления и источника питания.

Бактериологическое исследование на присутствие возбудителей анаэробных инфекций проводят при подозрении на следующие заболевания: ботулизм, энтеротоксемия овец, дизентерия ягнят, некробактериоз, столбняк, эмфизематозный карбункул (эмкар), злокачественный отек и брадзот овец.

В зависимости от подозреваемого заболевания отбор проб в лабораторию может быть различен. Так, для исследования направляют: при ботулизме -селезенку, кусочек печени, головной мозг и содержимое желудка; при энтеротоксемии овец и дизентерии ягнят - пораженную ; почку и содержимое кишечника; при некробактериозе - некротические фокусы паренхиматозных органов; при столбняке - кусочки тканей из глубоких слоев пораженных участков, гной (при наличии) и раневой секрет; при эмкаре и злокачественном отеке - кусочки пораженных мышц, лимфатические узлы, селезенку, кусочек печени и отечные ткани; при брадзоте овец -инфильтрированные ткани, подкожной клетчатки, кровь из сердца, слизистые оболочки сычуга и тонкого отдела кишечника. Материал заворачивают в целлофан или пергаментную бумагу, а жидкость (кровь, содержимое желудка и кишечника) помещают во флаконы, плотно закрывают резиновыми пробками и заливают сургучом. Кровь разрешается запаивать в пипетки.

Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала на питательные среды и биопробы на лабораторных животных.

К анаэробам, представляющим большую опасность для людей и животных, относят Cl. botulinum и Сl. реrfringers.

Cl. botulinum - слабо подвижная палочка длиной 4-8 мкм и шириной 0,6-0,8 мкм, по Граму окрашивается положительно. Спора обычно располагается на конце палочки, в связи с чем споровые формы микроба имеют вид теннисной ракетки или короткой свечи с пламенем. Вегетативные формы Cl. botulinum инактивируются при 80°С течение 30 мин., а споры, не погибают при кипячении даже в течение 4-5 ч. Cl. botulinum относят к группе сапрофитных почвенных микробов, широко расространенных в природе. Различают шесть серотипов этого возбудителя (А, В, С, Е, D, F), которые обладают различной патогенностью по отношению к животным и человеку. Последние заболевают ботулизмом только при проникновении в их организм токсинов, накопившихся в продуктах и кормах.

Cl. perfringens - короткая, спорообразующая, неподвижная, грамположительная палочка, анаэроб. Существуют 6 типов Cl. perfringens, обозначаемых начальными буквами латинского алфавита. Некоторые представители этих типов могут быть патогенными. Типы В, С, D, E являются возбудителями энтеротоксемии различных животных, а тип С также и возбудителем некротического энтерита людей.

В отличие от ботулизма пищевые заболевания, связанные с заражением продуктов Cl. perfringens, по-видимому, следует отнести к токсикоинфекциям.

Для бактериоскопии готовят 2-5 мазков-отпечатков Из каждой присланной пробы и окрашивают по Граму Или метиленовой синью, а при необходимости - на споры или капсулы. При микроскопировании обращают внимание на форму, наличие спор и капсул и расположение отдельных микроорганизмов.

Для посева на питательные среды пробы обжигают и навеску массой около 10 г растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором в соотношении 1 : 2.

По 3-5 мл приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см, предварительно прогретой на водяной бане при температуре 100ºС в течение 20-30 мин., а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 °С. Посевы перед термостатированием прогревают при температуре 80°С в течение 20 мин. (две пробирки); при исследовании на Cl. botulinum типа Е одну пробирку прогревают при температуре 60 °С в течение 15 мин. (при этом сохраняются споры Cl. botulinum E), а другую при 80 °С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

При подозрении на Cl. botulinum для выявления типа Е пробирки - одну непрогретую и одну прогретую до 60 °С - выдерживают при температуре 28°С.

Другие пробирки (непрогретую и прогретую при 80 °С) инкубируют при температуре 37 °С для выявления остальных анаэробов.

Термостатирование проводят в течение 5-10 сут.; наблюдают за ростом ежедневно. При обнаружении роста осуществляют микроскопическое исследование.

Для биологической пробы можно использовать присланный материал, а также чистую культуру. При подозрении на ботулизм биопробу ставят на белых мышах (реакция нейтрализации токсина противоботулинической сывороткой). Для этого исходный материал растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 :2, для экстрагирования токсина выдержи­вают 1 -1,5 ч при комнатной температуре, а затем филь­труют через ватно-марлевый фильтр или центрифугиру­ют при 3000 об/мин в течение 15-20 мин.

Далее проводят реакцию нейтрализации токсина; к 0,5-0,8 мл фильтрата (центрифугата) добавляют 0,24 мл смеси диагностических, моновалентных, противоботулинических сывороток типа А, В, С, D, E, F (по 0,04 мл каждого типа).

Двум мышам вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 0,5-0,8 мл исследуемого фильтрата. Центрифугат вводят в такой же дозе только внутривенно. Другим двум мышам вводят смесь фильтрата (центрифугата) и сыворотки, где токсин находится в нейтрализованном состоянии (контроль).

Аналогичный эксперимент можно провести с 6-7-месячной культурой, выращенной на печеночном бульоне. Пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и вводят белым мышам в той же дозе.

Если при введении необработанного противоботулинической сывороткой фильтрата мыши погибли, биопроба считается положительной, то есть в исследуемом материале имеется токсин. Мыши, которым вводили смесь фильтрата (центрифугата) с сывороткой, выживают.

В случае гибели всех четырех мышей повторяют реакцию нейтрализации токсина в фильтрате (центрифугате) в разведении в 5, 10, 20 и более раз и вновь ставят биопробу.

При обнаружении в присланных пробах ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации с типоспецифическими диагностическими сы­воротками для определения типа токсина.

При подозрении на энтеротоксемию овец и дизентерию ягнят взвесь в дозе 0,5-1 мл вводят внутримышечно кроликам или морским свинкам (гибель в течение суток); при подозрении на некробактериоз заражают подкожно кролика в область уха или мышь в область живота (по­являются некрозы); при подозрении на столбняк - вводят подкожно фильтрат из культуры в дозе 0,5-0,8 мл белым мышам в область корня хвоста (погибают на третьи-четвертые сутки); при подозрении на эмкар - заражают внутримышечно взвесью в дозе 0,5-1 мл мор­скую свинку (погибает через 16-96 ч.); при подозрении на злокачественный отек -вводят внутримышечно взвесь. в дозе 1 мл морской свинке или мышке (погибают через 12-24 ч.); при подозрении на брадзот овец заражают взвесью подкожно или внутримышечно морскую свинку в дозе 1 мл (погибает через одни-двое суток).

Таблица 3. Морфологические и культуральные свойства возбудителей анаэробных инфекций

Вид возбудителя	Краткая характеристика в мазках из материала	Окраска по Граму	Под-виж-ность	Форма и расположение спор	Капсу-лооб-ра-зова-ние	Характер роста на среде Китта-Тароцци
Возбудитель эмкара: Cl. chauvoei	Спорообразующая, полиморфная палочка с закругленными концами, располагается попарно или одиночно	Положитель-ная; в старой культуре отрицательная	+	Овальная, центральное или сублингваль-ное	-	Через 16-20 ч. - слабое равномерное помутнение, образуется газ.
Возбудитель злокачественного отека: Cl. septicum	Спорообразующая, поли­морфная палочка с закругленными краями, располагается одиночно, иногда цепочки или нити	Положитель-ная; в старой культуре отрицательная	+	Овальная; центральное или субцентральное	-	Через 16-24 ч. - равномерное помутнение с газом, за­тем наступает просветление с хлопьевидным осадком
Cl. oedematiens (Cl. novjyi)	Спорообразующая, крупная полиморфная палочка с обрубленными краями, иногда короткие цепочки	Положитель-ная; в старой культуре отрицательная	+	Овальная; центральное или субцентральное	—	Через 16-24 ч. - сплошное помутнение со слабым газообразованием, затем наступает просветление с хлопьевидным осадком
Cl. Perfringers	Спорообразующая, толстая палочка с закругленными концами	Положитель-ная, о старой культуре отрицательная	—	Овальная; централь-ное или субтерминальное	+	Через 5—6 ч. — равномерное помутнение с бурным газообразованием; через 48 ч. — просветление с обильным осадком
Cl. histolyticum	Спорообразующая, мелкая палочка с закруг-ленными концами; располагается одиночно, парами или цепочками	Положительная	+	Овальная; централь-ное или субтерминальное (форма игольного уш­ка)	—	Через 5—6 ч. — равномерное помутнение, без газообразования с последующим просветлением и образованием осадка
Cl. sordelli	Спорообразующая, полиморфная палочка с закругленными краями; располагается, одиночно, но 2—3 вместе, редко цепочками	Положительная	+	Овальная; централь-ное или субтерминальное	—	Через 24 ч. — интенсивное помутнение и газ; в старых культурах дает осадок, который тянется в виде слизистых нитей
возбудитель энтеротоксимии овец : Cl. Perfringers – типы A, C, D	Спорообразующая, толстая палочка с закругленными концами	Положитель-ная, о старой культуре отрицательная	—	Овальная; централь-ное или субтерминальное	+	Через 5—6 ч. — равномерное помутнение с бурным газообразованием; через 48 ч. — просветление с обильным осадком
возбудитель брадзота овец: Cl. septicum Cl. oedematiens	Спорообразующая, поли­морфная палочка с закругленными краями, располагается одиночно, иногда цепочки или нити	Положитель-ная; в старой культуре отрицательная	+	Овальная;центральное или субцентраль-ное	—	Через 16—24 ч. — равномерное помутнение с газом, за­тем наступает просветление с хлопьевидным осадком
Возбудитель столбняка: Cl. tetani	Спорообразующая крупная тонкая палочка с закругленными концами; располагается одиночно или группами (по 2—3 клетки), из жидких сред — длинные нити	Положительная, в старой культуре отрицательная	+	Круглая; концевое в виде барабанной палочки	—	Через 24-36 ч. - неинтенсивное помутнение, через 48-72 ч. - просветление с рыхлым осадком; запах жженого рога
Возбудитель ботулизма: Cl. Botulinum (типы A, B, C,D, E И F)	Спорообразующая, толстая палочка с закругленными краями; располагается одиночно, парами или в виде коротких цепочек	Положительная; в старой культуре отрицательная	+	Овальная; субтерминальное, реже централь- ное в виде теннисной ракетки	—	Через 24-36 ч. - помутнение, слабое газообразование; затем - просветление; запах прогорклого масла
Возбудитель некробактериоза: Bact. necrophorum	Неспорообразующая, полиморфная палочка или длинные зернясто окрашенные нити	Отрицательная	—	Не образует	—	Через 24-48 ч. помутнение, слабое газообразование; через 5-8 сут. - просветление с крошковатым осадком