Общие методы исследования.

Исследование морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов.

Приготовление мазков. Мазки готовят на обезжиренных предметных стеклах. При приготовлении мазка из культуры ( на плотной среде) на предметное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора, затем при соблюдении правил асептики, захватив прокаленной и остуженной бактериологической петлей немного материала, размещают его в этой капле. Полученную взвесь размазывают на площади приблизительно 1см². Культуру микроба из жидкой питательной среды берут пастеровской пипеткой или петлей, и готовят препарат аналогично способу, указанному выше.

Для фиксации мазка наиболее простым и распространенным способом является трехкратное медленное проведение препарата ( мазком вверх) через пламя горелки, таким образом, чтобы он находился в пламени не более 2 секунд.

Окраска мазков. Существуют простые и сложные способы окраски.

При пользовании простым способом окраски препаратов на приготовленный и зафиксированный мазок наливают водный раствор фуксина на 1-2 мин или раствор метилиновой сини – на 3-5 мин. Затем краску сливают, мазок промывают дистиллированной водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Чаще используют окраску по Граму ( сложный способ). На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генцианвиолета ( генцианвиолета – 1г, спирт 96º 100мл) и наносят 2 капли воды, которая полностью впитывается бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Красят 2 минуты, затем бумажку удаляют пинцетом и, не промывая водой, наносят на мазок раствор Люголя. Через 1 мин раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96º спиртом – 0,5-1мин. Затем мазок промывают водой и окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1-2 мин. Сливают краску, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой : грамположительные микробы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные в розово-красный.

Окраска капсул. Для окраски капсул применяют следующие основные методы : Романовского-Гимзе, Ребигера, Ольта, Михина и др.

Метод Романовского- Гимзе. Разведенную краску ( готовят рабочий раствор : 15-20 капель краски на 10мл дистиллированной воды) наливают в чашку Петри, на дно которой кладут две две тонкие стеклянные палочки или спички. Предварительно зафиксированный метиловым спиртом или спирт-эфиром мазок, после высыхания кладут намазанной поверхностью вниз и наливают краску до соприкосновения с мазком. Окрашивают в течение 30-40 минут, затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Микробы окрашиваются в сине- фиолетовый, капсулы –розово-красный цвет.

Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно. Для этого готовят следующий раствор. 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40% формалина, оставляют раствор на 16-18 часов при 18-20ºС, затем фильтруют, после чего он готов к употреблению. Нефиксированные мазки окрашивают в течение 15-20 сек, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Микробы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы – в красновато-фиолетовый.

Метод Ольта. Препарат окрашивают 1-2% водным раствором сафранина в течение 0,5-1 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Микробы окрашиваются в темно-красный цвет, капсулы – в желтый.

Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффера в течение 2-3 мин при подогревании ( до появления паров), после чего краску смывают водой и высушивают мазок между листками фильтровальной бумаги. Микробы окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы – в светло-розовый.

Определение подвижности микроорганизмов (метод висячая капля).

Края предметного стекла с лункой смазывают тонким слоем вазелина. На чистое профламбированное и остывшее покровное стекло в центр помещают маленькую каплю культуральной жидкости. Предметным стеклом лункой книзу накрывают каплю так, чтобы она оказалась под центром лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. Висячая капля не должна касаться дна и краев лунки.