Метод і експериментальна установка

Опис установки. Мікроскоп є одним з найважливіших лабораторних приладів у медичних і біологічних дослідженнях. Мікроскопи широко застосовують для спостереження і дослідження таких об'єктів, що неможливо розрізнити неозброєним оком.

У цій лабораторній роботі ми будемо використовувати біологічний мікроскоп для вимірювання біологічних об’єктів.

Побудова зображення предмета в мікроскопі подана на рис. 2.1. Оптична система мікроскопа складається з двох систем лінз: об'єктива й окуляра. Для простоти побудови зображення (рис. 2.1) система лінз об'єктива замінена однією збираючою лінзою Л_І, а система лінз окуляра – лінзою Л₂ Предмет АВ переміщується перед об'єктивом; трохи далі його фокуса. Об'єктив створює збільшене дійсне зображення А'В' предмета поблизу переднього фокуса окуляра, що розглядається оком через окуляр. Можливі три випадки взаємного розташування окуляра і зображення А'В': 1) зображення А'В' знаходиться трохи ближче переднього фокуса окуляра F₂ (окуляр створює збільшене уявне зображення А"В", що проектується на відстань найкращого зору); 2) зображення А'В' лежить у фокальній площині окуляра (зображення, утворюване окуляром, проектується на нескінченність і око спостерігача, працює без акомодації); 3) зображення А'В' знаходиться далі переднього фокуса окуляра (зображення, утворюване окуляром, буде дійсним, збільшеним). Таке розташування окуляра застосовується для мікропроекції і мікрофотографії. Збільшення мікроскопа Г дорівнює

,

де Δ – оптична довжина тубуса; S – відстань найкращого зору; f₁ – фокусна відстань об'єктива; f₂ – фокусна відстань окуляра.

Можна припустити, що підбираючи відповідним чином значення розмірів ƒ₁, ƒ₂ і Δ, одержимо мікроскоп із різним збільшенням. Проте на практиці використовують мікроскопи зі збільшенням понад 1500 – 2000 разів, тому що можливість розрізнення дрібних деталей об'єктивом мікроскопа обмежена. Це обмеження відбувається під впливом дифракції світла, що відбувається в структурі аналізованого об'єкта. У зв'язку з цим користуються поняттями межа розрізнення і розрізнююча спроможність мікроскопа.

Межа розрізнення мікроскопа визначається за формулою:

Ζ = λ/(2n sin u ),

де λ – довжина хвилі світла, що освітлює предмет; п – показник заломлення середовища між об'єктивом і предметом; u – апертурний кут об'єктива, рівний половині кута між крайніми променями конічного світлового пучка, що входить в об'єктив мікроскопа. Величина А = n sin u є числовою апертурою. Тоді

Ζ = λ/(2A) . (2.1)

Ця формула справедлива у випадку освітлення предмета збіжним пучком променів.

Рис. 2.1. Побудова зображення предмета у мікроскопі

З огляду на наявність межі розрізнення мікроскопа, межі розрізнення ока, вводять поняття корисного збільшення мікроскопа. Це таке збільшення, при якому мікроскоп створює зображення предмета, що має розміри, рівні межі розрізнення Z мікроскопа, і розміри цього зображення дорівнюють межі розрізнення Z_гл неозброєного ока на відстані найкращого зору

Г = Ζ_гл./ Ζ. (2.2)

Нормальне око на відстані найкращого зору розрізняє дві точки предмета, якщо кутова відстань між ними не менша 1', що відповідає

відстані між цими точками порядку 70 мкм. У цьому випадку корисне збільшення буде мінімальним:

Г_min = 70 / Ζ .

Вважають, що око найменше стомлюється при розгляданні предметів, розміри яких у 2 – 4 рази більше межі розрізнення ока (на відстані найкращого зору). Тому звичайно використовують мікроскопи з корисним збільшенням у межах 2Г_min - 4Г_min .

Якщо у формулу (2.2) підставити формулу (2.1), отримаємо

Г = 2 Ζ_гл A / λ.

При освітленні об'єкта білим світлом довжину хвилі вважають рівною 0,555 мкм, тому що око до нього найбільш чутливе. Таким чином, корисне збільшення мікроскопа звичайно знаходиться в інтервалі 500А<Г< 1000А.

У медичних і біологічних дослідженнях мікроскоп часто використовують для виміру розмірів малих об'єктів. З цією метою мікроскоп обладнують спеціальним пристроєм – окулярно-гвинтовим мікрометром, що являє собою насадку, що одягається на верхній кінець тубуса мікроскопа замість окуляра.

Оптична частина мікрометра складається з лінзи-окуляра, нерухомо закріпленої скляної шкали і рухливої скляної пластини, на якій нанесені перехрестя і два вертикальні штрихи над ним, паралельні рискам шкали.

Скляна пластина з перехрестям переміщується вздовж шкали мікрометра за допомогою мікрометричного гвинта.

Окулярно-гвинтовий мікрометр закріплюють на тубусі так, щоб скляна шкала знаходилася в площині, у якій розташоване дійсне зображення предмета, що утворює об'єктив мікроскопа. При цьому зображення шкали при розгляданні в окуляр сполучається з зображенням предмета. Переміщуючи за допомогою мікрогвинта рухливу пластину, можна сполучити перехрестя спочатку з одним краєм аналізованого предмета, а потім з іншим. При цьому можна визначити, якій кількості рисок шкали мікрометра відповідає дане зображення.

Переміщення пластини з перехрестям на одну поділку шкали мікрометра відповідає одному повному оберту мікрометричного гвинта. Барабан мікрометричного гвинта розділений на 100 рисок; отже, за допомогою окулярно-гвинтового мікрометра можна робити виміри предметів з точністю до 0,01 поділки шкали.

Для визначення розмірів предмета необхідно знати ціну поділки окулярно-гвинтового мікрометра. Під ціною поділки окулярно-гвинтового мікрометра розуміють виражену в міліметрах довжину відрізка, що аналізується у мікроскопі, зображення якого займає одну поділку шкали мікрометра.

Для визначення ціни поділки окулярно-гвинтового мікрометра застосовують об'єктний мікрометр – шкалу з відомою ціною поділки. Об'єктний мікрометр розглядають під мікроскопом як предмет і, поєднуючи в полі зору об'єктну і окулярну шкали, визначають ціну поділки окулярного мікрометра.

Для цієї мети можна також використовувати будь-який предмет, розмір якого відомий. Зокрема, для градуювання окулярно-гвинтового мікрометра застосовують розрахункову камеру Горяєва, використовувану в медичних вимірюваннях для підрахунку формених елементів крові. Камера Горяєва являє собою скляну пластинку, на якій нанесена сітка, що розбиває поле зору на квадрати з відомою довжиною сторони: сторона малого квадрата – 0,05 мм, великого – 0,2 мм.

На рис. 2.2 зображений зовнішній вигляд (а) і схема пристрою (б) біологічного мікроскопа. Оптична система мікроскопа ділиться на дві частини: освітлювальну і спостережливу. Освітлювальна частина складається з рухливого дзеркала 1, яке направляє промені від освітлювача на аналізований об'єкт, конденсора 2, що утворює на

об'єкті збіжний пучок світла; знімального світлофільтра 4 і укріпленої на конденсорі ірисової апертурної діафрагми 3 для регулювання освітленості об'єкта. Спостережлива частина складається з об'єктива 5, окуляра 7 і призми 6, що служить для направлення вертикальних променів, що пройшли об'єктив, в похилий тубус. Об'єктив являє собою систему лінз, зібраних в єдиній оправі. Передня лінза служить для збільшення, інші – призначені для виправлення недоліків зображення, отриманого передньою лінзою. Окуляр мікроскопа звичайно складається з двох лінз: верхньої – для ока і нижньої – збираючої, необхідної для того, щоб усі промені, що пройшли через об'єктив, потрапили в лінзу окуляра.

Біологічний мікроскоп має три об'єктиви, які дають різноманітне збільшення, що закріплені в револьвері 11, і три змінних окуляри.

Рис. 2.2. Схема біологічного мікроскопа МБР-1

Механічна система мікроскопа складається з масивної підставки 8, тубусоутримувача, коробки з мікрометричним механізмом 9 для переміщення тубуса і предметного столика 10, на якому укріплені пружини, що притискають препарат до предметного столика.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи, оформлення й обробка результатів експерименту

1. Визначення ціни поділки окулярно-гвинтового мікрометра. Покласти на предметний столик камеру Горяєва. Одержати чітке зображення камери в окулярі мікроскопа. Повертаючи предметний столик, домогтися того, щоб вертикальні сторони клітин камери Горяєва були паралельні рискам шкали окулярно-гвинтового мікрометра. Обертаючи барабан мікрогвинта, встановити перехрестя окулярно-гвинтового мікрометра на вертикальну сторону якоїсь клітини камери Горяєва. Зняти показання п₁ окулярного мікрометра. Перемістити перехрестя на N клітин камери Горяєва, сполучити його з вертикальною стороною N-ї клітини. Зняти показання п₂ окулярно-гвинтового мікрометра. Визначити ціну поділки δ окулярно-гвинтового мікрометра δ = aN/(n₂ –n₁), де а - розмір сторони клітини камери Горяєва. Визначити ціну поділки δ окулярно-гвинтового мікрометра ще декілька разів, переміщуючи перехрестя щоразу на різне число N клітин камери Горяєва..

Знайти середнє значення ціни поділки окулярно-гвинтового мікрометра.

Результати вимірів і обчислень занести в табл. 2.1. Визначити похибку Δδ виміру ціни поділки окулярно-гвинтового мікрометра з довірчою вірогідністю α = 0,95.

2. Визначити розміри еритроцитів крові. Покласти на предметний столик мікроскопа гістологічний препарат крові.

Одержати чітке зображення еритроцитів в окулярі мікроскопа.

Сполучити перехрестя окулярно-гвинтового мікрометра з одним з країв еритроцита і зняти показання т₁ окулярного мікрометра.

Сполучити перехрестя з іншим краєм еритроцита, і зняти показання m₂ . Визначити розмір l=(m₂–т₁)δ еритроцита.

Зробити вимір розмірів для трьох різних еритроцитів. Результати вимірів і обчислень занести в табл. 2.2. Визначити похибку Δl виміру розміру еритроцита з довірчою вірогідністю α= 0,95.

Таблиця 2.1

N	а, мм	nІ	n2	n1-n2	<δ>, мм

Таблиця 2.2

<δ>, мм	m1	m2	m1 – m2	l,мм

3. Визначити концентрації еритроцитів і лейкоцитів у препаратах крові за допомогою камери Горяєва (рис.2.3).

Підрахунок червоних і білих тілець. Підрахунок проводиться в лічильних камерах. Лічильна камера являє собою скляну пластинку з невеличким поглибленням у центрі, куди поміщають розведену кров. На дні цього поглиблення розміщена сітка визначеного розміру. Між дном поглиблення і покривним склом висота (або глибина камери) дорівнює 0,1 мм. Кров'яні тільця осідають на дно камери, на сітку і рахуються. Порахована площа сітки, глибина камери і розведення крові відомі, і тому може бути вирахувана кількість кров'яних тілець в 1мм³ крові. Площа сітки Горяєва дорів­нює 9 мм² і містить 1515 великих квадра­тів різноманітних рисунків. 25 квадратів розділені на 16 маленьких квадратиків. У сітці є порожні квадрати, зібрані в групи, по 4 квадрати кожна. Усього таких груп у сітці – 25 (55), що містять 100 великих порожніх квадратів.