1.7.2 Краткая характеристика аллохтонных микроорганизмов

Бациллы (лат. Bacillus) – обширный (около 217 видов) род строго аэробных или факультативно анаэробных хемоорганогетеротрофных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные термоустойчивые эндоспоры [31]. Особенностью этой группы бактерий является широкий диапазон оснований ДНК 32-69 мол. % гуанина и цитозина. Размножаются поперечным делением клеток. Ветвление и почкование клеток как способ размножения не отмечены. Поперечный размер клеток варьирует в пределах 0,4–2 мкм. Вегетативные клетки имеют вид прямых или слабоизогнутых палочек с параллельными сторонами и округлыми концами, которые в редких случаях резко обрезанные.

Расположение клеток различное – от одиночных до длинных цепочек. За исключением сибиреязвенной бациллы бактерии этого рода подвижные, снабжены перитрихиально расположенными жгутиками.

Большинство видов является грамположительными бактериями, часть – грамвариабильными. Клетки хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красками. Ни один представитель рода не является типично кислотоустойчивым организмом. У многих видов отмечается наличие внутриклеточного жира, гликогена, волютина и других включений. Капсула встречается лишь у сибиреязвенной бациллы и некоторых других видов при специфических условиях роста.

Большинство видов, исключая некоторые, главным образом энтомопатогенные формы, хорошо растут на мясопептонном агаре (МПА) при реакции среды, близкой к нейтральной. Отдельные виды развиваются в щелочной среде и требуют особых источников азота или углерода.

Культуральные особенности видов, выросших на разных средах, резко различны. На твердых питательных средах образуются колонии от 1–2 до 5 мм и более в диаметре: гладкие, зернистые, пленчатые, складчато-морщинистые и сухие, слизеобразующие и пастообразные с характерной структурой края. При развитии на жидких средах обнаруживается тенденция к образованию поверхностной пленки. Встречаются виды, образующие на поверхности агаризованных сред подвижные колонии.

Большинство видов активно продуцируют ферменты, гидролизующие белки, крахмал и другие субстраты. Многие виды обладают антагонистическими свойствами и бациллы вырабатывают антибиотики полипептидной природы. Отдельные виды нуждаются в присутствии витаминов, аминокислот и других дополнительных факторов роста. Кислоту и газ продуцируют лишь бактерии некоторых видов, все остальные при росте на углеводах образуют кислоты. Оптимальная температура роста обычно варьирует в пределах 30–40° С. Встречаются виды, развивающиеся при температуре ниже 12°С и выше 50°С.

До 1991 года в род Bacillus входило большое количество весьма несхожих видов, как на генотипическом уровне, так и на уровне фенотипа (Internacional Journal of Systematic Bacteriology, 1997). Сравнения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК 51 вида выявило по крайней мере 5 филогенетических групп. Хорошо изучены только те виды, которые имеют практическое значение (патогенные, бродильные формы, продуценты различных антибиотиков, ферментов и т.д.). Вопросы систематики спорообразующих бактерий изучались специалистами прикладных наук для диагностических целей, в основном санитарно-гигиенического назначения. Систематика рода Bacillus претерпела большие изменения за прошедшее время в связи с разъяснением филогенетических отношений внутри семейства Bacillaceae.

Представители Bacillus отличаются высоким и разнообразным спектром биологической активности. Часто обладая явным антагонизмом к патогенным микроорганизмам, они продуцируют целый ряд ферментов, лизирующих крахмал, пектины, целлюлозу, жиры, белки, производят различные аминокислоты и антибиотики [413, 496, 590]. Пробиотические препараты разработаны на основе таких видов, как coagulans, subtilis, clausii, cereus, toyoi, lichemiformis, mesentericus, polymyxa, amyloliquefaciens и др. [605] (табл. 1.12).

Bacillus subtilis (сенная палочка) – грамположительные крупные палочки (рис. 1.17.) с закругленными концами (1,0–1,3×4,6–5,5 мкм). Температура роста, °С: минимальная 5–20, оптимальная – 37±1, максимальная – 45–55. Споры размером 0,8×1,2 мкм, эллиптической или цилиндрической формы, расположены центрально.

Факультативный аэроб. На жидких питательных средах образует пленку серовато-белого цвета; на плотной питательной среде образует R-форму –

Р и с 1.17. Ваcillus subtilis [Microbe Wiki]

складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями размером 3×5 мм, легко снимающиеся петлей. Разлагает глюкозу на кислоту, ацетон, газ не образует. Окрашиваемость вегетативных клеток по Граму, спор – по Цилю-Нильсону. Являются нормальными обитателями кишечника человека и животных. Широко распространены в природе. Обнаруживаются в пресной и морской воде, в почве (особенно в загрязненной фекалиями и навозом). Участвуют в процессах аммонификации (разложении белков и нуклеиновых кислот), минерализуют органические соединения азота, обеспечивают пополнение запасов минерального азота в почве. Являясь обитателями ризосферы, могут ингибировать рост растений. Являются продуцентами биологически активных веществ – ауксинов. Используются при биологической переработке и обеззараживании фекальных нечистот и сточных вод на полях ассенизации, орошения. Восстанавливают железо. Патогенны для гусениц тутового шелкопряда – вызывают кишечный токсикоз. При снижении иммунной защиты у человека и животных вызывают гнойно-вос-палительные процессы. Часто обнаруживается в сыром молоке, а также молочных продуктах. Способствуют ферментации молочного белка, в результате которой образуются вещества с горьким вкусом и продукт теряет свои вкусовые качества [31].

Р и с. 1.18.Ваcillus polymixa [Microbe Wiki]

Bacillus polymixa – палочковидная бактерия размером 2–5×0,6–0,8 мкм (рис. 1.18), формирует термостабильную овальную эндоспору, превышающую размер клетки (клетка имеет форму лимона). Синтезируют леван из сахарозы, формируют слизистую капсулу. Растет на простых питательных средах. На агаризованных питательных средах формируют бесцветные, плоские или выпуклые, гладкие и слизистые колонии с пильчатым краем.

Образует каталазу, гидролизирует казеин, желатин и крахмал. Некоторые штаммы способны гидролизовать целлюлозу. В аэробных условиях разлагает пектиновые вещества, которые склеивают клетки деревенеющих растений. Деятельность этих микробных клеток проявляется при замачивании льна, конопли и других подобных растительных культур. Бациллы участвуют в процессах восстановления марганца, являются азотфиксаторами. Некоторые штаммы являются продуцентами полисахаридов, лектинов, полипептидных антибиотиков – полимиксинов.

Bacilius licheniformis – палочковидные, грамположительные бактерии (рис. 1.19.), в почве образуют споры, что используется в промышленных целях для производства ферментов, антибиотиков (бацитрацин), моющих средств и метаболитов, обладающих фунгицидным действием.

Р и с. 1.19. Ваcillus licheniformis [Microbe Wiki]

Оптимальная температура роста (37±1)°С. Факультативный анаэроб. На МПБ (pH 7,3±0,1) через 24 ч инкубирования образует помутнение среды, на поверхности – сухую пленку; на МПА (7,3 ± 0,1) – слабо выпуклые сухие колонии вытянутой звездчатой формы с неровными краями диаметром 4–6 мм, врастающие в питательную среду. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Ферментирует глюкозу с образованием кислоты и газа. Редуцирует нитраты, образует газ в среде для нитрификации в анаэробных условиях. Утилизирует пропинат. Гидролизует крахмал. Расщепляет аргинин. Не образует индол, лецитиназу, кислоту в лакмусовом молоке.

Содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет около 46,2 моль%. Производит протеазы устойчивые к высокому уровню рН.

Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально, не выходят из размеров спорангия, очень устойчивы к температурным, радиоактивным и химическим факторам.

В большом количестве находится в пыли и на птичьих перьях. Загрязненные Bacillus licheniformis молочные продукты, овощи, хлебобулочные и колбасные изделия вызывают пищевую токсикоинфекцию.

Р и с. 1.20. Ваcillus cereus [Microbe Wiki]

Bacillus cereus – грамположительные спорообразующие палочки (0,5–2,5×1,2–10 мкм). Подвижные, перитрихи. Располагаются цепочкой или штакетообразмыми скоплениями, реже в виде одиночных клеток (рис. 1.20.). Аэробы или факультативные анаэробы. Споры в спороносной клетке распологаются эксцентарично, при этом клетка приобретает веретенообразную форму. Наиболее распространенные в почве микроорганизмы. Являются условно патогенными. Нередко обнаруживаются в молоке и молочных продуктах. Микроорганизмы этого вида при размножении в продуктах (в т.ч. молочных) способны вызывать пищевые отравления.

Bacillus coagulans – представлены грамположительными, спорообразующими, подвижными палочками (0,9×3,0–5,0 мкм). Факультативный анаэроб. В процессе культивирования образует молочную кислоту (рис. 1.21.). Оптимальная температура роста 30–55°C. Имеет статус GRAS «В целом безопасные» для производства медикаментов в ветеринарных и медицинских целях.

Р и с. 1.21.Ваcillus coagulans [Microbe Wiki]

Часто используется в ветеринарии в составе пробиотиков для свиней, крупного рогатого скота, птиц, а также в аквакультуре. Литературные данные свидетельствуют об эффективности применения Bacillus coagulans при синдроме раздраженного кишечника, кольпите, для повышения иммунного ответа [28]. Один штамм (Bacillus coagulans GBI-30, 6086) оценен по безопасности в качестве пищевого ингридиента, используется при производстве йогуртов и кефира.

Р и с. 1.22. Ваcillus clausii [Microbe Wiki]

Bacillus clausii - грамположительная, аэробная, эндоспорообразующая, факультативная палочко-видная бактерия (рис. 1.22.). B. clausii продуцирует каталазу и оксидазу, гидролизует желатин и крахмал, восстанавливает нитраты, растет при температуре от 30 до 50°C и в присутствии NaCl (до 10%). Совокупное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет около 43 моль% [656].

Часто обнаруживаются как составляющие микрофлоры почвы, используются в промышленности и биотехнологии в производстве щелочной протеазы и ксиланазы [560, 627]. Наряду с прочими спорообразующими бациллами является важным для человека пробиотиком [677].

Р и с. 1.23. Вrevibacillus [Visualphotos]

Род Brevibacillus. Этот род аэробных спорообразующих бактерий возник после повторной генетической классификации штаммов, ранее входивших в группу Bacillus brevis [682]. В настоящее время все 10 видов (brevis, agri, centrosporus, choshinensis, parabrevis, reuszeri, formosus, borstelensis, latero-sporus, thermoruber) официально признаны как представители рода Brevibacillus (рис. 1.23.). Пробиотические свойства представителей рода Brevibacillus исследованы мало. Тем не менее, на основе бревибацилл уже созданы два пробиотика (см. табл. 1.12). Было обнаружено, что культура Br. laterosporus обладает ларвицидной активностью, Br. Magula вырабатывает антибиотик грамицидин, а штаммы Br. agri, Br. brevis и Br. laterosporus даже опасны для человека. Показано, что штаммы Br. laterosporus отличаются значительным генетическим разнообразием – у 29 из них были выделены 14 отдельных фрагментов на хромосоме [711].

Род Clostridium. Спороносные бактерии, клетки которых при спорообразовании раздуваются в центре и приобретают форму веретена (Clostridium; от греч. kloster – веретено). В большинстве – анаэробы и хемоорганотрофы с бродильным типом метаболизма. Одни виды сахаролитические, другие – протеолитические, третьим свойственны в разной степени те и другие качества. Некоторые виды фиксируют азот, сульфаты не восстанавливают, каталазы обычно не образуют. Встречаются в почве, осадках водоемов и в пищеварительном тракте человека и животных [233]. В настоящее время описан 61 вид, но только 12 из них патогенные микроорганизмы.

Клинически значимые виды клостридий – C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. chauvoei, C. septicum, C. novyi, C. histoliticum, C. sordelli, в вегетативном состоянии секретируют мощные экзотоксины, вызывая такие очень тяжелые заболевания человека и животных, как столбняк, ботулизм, газовая гангрена, пищевые токсикоинфекции.

Еще один вид – C. difficile опасен тем, что он, часто обитая в толстом кишечнике, при лечении антибиотиками может вызывать серьезную инфекцию – псевдомембранный колит [636]. А C. chauvoei вызывает эмфизематозный карбункул у крупного рогатого скота. Вместе с тем, другие виды клостридий входят в состав нормальной микрофлоры кишечника человека и животных, достигая уровня численности 8,1 x 10⁹ КОЕ/г [228].

Пока только три вида Clostridium – С. thermocellulolyticus, C. locheadii [440] и C. butyricum [660], являются компонентами пробиотиков.

Последний из них был найден доктором Miyairi еще в 1938 г. и поныне популярен в Японии и Корее [666].

Ри с. 1.24. Clostridium butyricum [Microbe Wiki]

Clostridium butyricum – это типовой представитель рода Clostridium (рис. 1.24). Нередко встречается в молоке, натуральных и плавленых сырах, молочных консервах. Способен вызывать пороки вкуса, запаха и консистенции молочных продуктов, вспучивание сыров. Микроорганизмы данного вида представляют собой крупные прямые или слегка искривленные палочки, толщина которых колеблется от 0,7 до 1,9 мкм, а длинна – от 3,5 до 7,0 мкм. Клетки распологаются обычно по одиночке или парами, реже в коротких цепочках. Споры в спороносных клетках распологаются эксцентрично, при этом спороносная клетка слегка раздувается. Спора овальная (Клив де В. Блэкберн, 2010).

Ри с. 1.25. Saccharomyces boulardii [Microbe Wiki]

Род Sporolactobacillus. Клетки прямые, подвижные, грамположительные, образуют эндоспоры. Хемоорганотрофы. Метаболизм бродильный. Гексозы расщепляют по типичному гомоферментативному пути с образованием одной лишь молочной кислоты. Каталазу не образует. Факультативно анаэробные или микроаэрофильные бактерии с температурой роста 25 - 40°C. (Kitahara,196). К настоящему времени извесны 8 видов Sporolactobacillus – Sp. dextrus, Sp. inulinus, Sp. kofuensis, Sp. laevis, Sp. lactosus, Sp. nakayamae, Sp. terrae, Sp. vineae. Для этого рода мольное содержание G+C пар составляет 43–47%.

Первоначально представителей Sporolactobacillus относили к роду Lactobacillus, но впоследствии их повысили до статуса рода, но уже в семействе Bacillaceae. Различие Sporolactobacillus от рода Lactobacillus было выявлено по исследованию ДНК-ДНК гибридизации (Dellaglio 1975). Кроме того, жирнокислотная конфигурация и изопреноид-хиноновые компоненты клеток Sporolactobacillus оказались общими с группой Bacillus и отличались от таковых у Lactobacillus [552].

В настоящее время несколько штаммов Sp. inulinus и Sp. vineae в Китае и Южной Корее имеют патенты пробиотических культур. Препараты, содержащие эти штаммы, находятся на стадии опытной серии.

Дрожжи представляют собой одноклеточные крупные (3,0–5,3×3,5–12,0 мкм) неподвижные микроорганизмы (безмицелиальные грибы) круглой, овальной или продолговатой формы. Широко распростанены в природе. Они содержатся в почве, растениях, силосе, окрудающем воздухе. Нередко они присутствуют на оборудовании, откуда дрожжи попадают в молоко, производственные закваски, различные молочные продукты. Содержание дрожжей в молоке обычноот 100 до 10000 в мл, но может резко возрасти при скармливании коровам кормов на основе дрожжевой биомассы или обогащенных дрожжами кормов. Дрожжи используются при производстве ацидофильно-дрожжевого молока, молочного кваса, выработке кумыса и кефира. Излишнее развитие дрожжей может привести к появлению пороков молочных продуктов (дрожжевой вкус, вспучивание заквасок, бомбаж сгущенного молока). Дрожжевая микрофлора сырого молока довольно разнообразна, но чаще всего присутствуют дрожжи родов Candida, Torulopsis, Saccharomyces.

S.boulardii – овальные или сферические, реже удлиненные клетки диаметром до 10 мкм, соединены по два или в небольшие группы; мицелия не образуют. Эти непатогенные дрожжи выделены из тропических плодов личи в Индонезии (рис. 1.25.). Содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 26–48моль%. Оптимальная температура роста 37°C. В лиофилизированном виде применяются в качестве активного вещества в противодиарейных, антимикробных лекарственных препаратах. Клинические и эксперементальные исследования S.boulardii продемонстрировали иммуномоделирующий, противовоспалительный, антимикробный, ферментный, метаболический и антитоксический эффект. [28, 215].